野生型阻断PCR检测低频体细胞突变

野生型阻断聚合酶链式反应（WTB-PCR）通过选择性扩增低丰度的突变等位基因，同时抑制DNA样本中高丰度野生型等位基因的扩增，从而检测点突变。

WTB-PCR 利用锁核酸（locked nucleic acids，LNA）或含锁核酸的单链修饰寡核苷酸，其与样本的野生型 DNA 链互补并特异性结合于互补链。LNA 的结合可阻断 DNA 聚合酶的活性，从而抑制野生型模板 DNA 的延伸。

进行 WTB-PCR 时，取含有 dNTPs、LNAs 以及靶标特异性正向和反向引物的预混液，溶于无核酸酶的蒸馏水中。

向管中加入含有耐热DNA聚合酶的溶液，并用移液器将混合液加入PCR板的孔中。将含有野生型和突变型DNA的基因组DNA样本加入孔中，然后开始PCR反应。

在PCR过程中，高温介导的变性使双链DNA解离。解离后的单链作为模板，使引物得以退火，同时LNA与互补的野生型DNA链结合，形成阻断物-野生型DNA杂交体。在较高温度下，DNA聚合酶添加dNTP并延伸引物-DNA模板。

LNA-DNA 杂交体的熔解温度高于 DNA-DNA 复合物，因此更稳定。LNA 的修饰最终会阻碍 DNA 聚合酶对 LNA-DNA 杂交体的延伸，从而抑制其延长。

经过多个PCR循环，LNA介导的阻断作用可增加样品中突变型扩增子相对于其野生型变体的数量，从而有助于选择性检测突变型。

正向和反向引物设计时在5'端包含M13序列，以便互补测序引物能够退火。阻断寡核苷酸的设计长度应约为10至15个碱基，并与希望实现突变富集的野生型模板区域互补。

较短的寡核苷酸可提高错配 discrimination 能力。为实现高靶标特异性，应避免使用过多的阻断核苷酸，否则会导致寡核苷酸的非特异性结合能力显著增强。

设计阻断寡核苷酸时，首先访问 Oligo Tools 网站。选择 “Oligo T_M 预测” 工具，新窗口将打开。将要阻断的野生型模板序列粘贴到 “寡核苷酸序列” 框中。在阻断碱基前添加加号以标记它们。点击 “计算” 按钮，以确定DNA阻断杂交体的近似T_M值。计算出的熔解温度将显示在下方的框中。

设计阻断寡核苷酸时，其熔解温度应比热循环过程中的延伸温度高10至15摄氏度。此处延伸温度为72摄氏度。为调节熔解温度，可添加、删除或替换阻断碱基。应避免出现连续三个或四个阻断的C或G碱基。

接下来，为避免二级结构形成或自身二聚化，返回到 Oligo Tools 网站的主界面，选择 “Oligo Optimizer” 工具。新窗口将打开。将需要被阻断的野生型模板序列粘贴到输入框中，并添加加号以标明阻断碱基。勾选 “Secondary Structure” 和 “Self Only” 两个选项，然后点击 “Analyze” 按钮，查看杂交和二级结构的评分结果。

这些分数分别代表了自生二聚体和二级结构熔解温度的粗略估计值。较低的分数更为理想，可通过限制阻断剂之间的配对来实现。为获得更低的分数，需移除或重新定位阻断核苷酸。此处所示针对 MyD88 的优化阻断寡核苷酸，在 DNA 阻断剂杂交熔解温度与足够低的杂交及二级结构分数之间达到了平衡。

其设计覆盖氨基酸 Q262 至 I266，并在 3' 端采用反向的 dT，以抑制 DNA 聚合酶的延伸作用和 3'-外切酶的降解作用。引物设计完成后，按照随附文件中的说明设置野生型阻断 PCR 并进行热循环反应。