用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术

为了利用免疫荧光显微技术在 DNA 双链断裂（DSB）位点可视化特定的 DNA 损伤应答蛋白，首先准备载有含 DSB 的人单核细胞单层的显微镜载玻片。用多聚甲醛固定细胞。

使用非离子型去污剂处理，使膜通透化以接触细胞内靶标。加入含蛋白质的封闭液，封闭细胞的非特异性结合位点。孵育可结合靶标响应蛋白的一抗。

使用带有不同荧光染料标记的二抗混合物进行孵育，使其特异性结合至与蛋白质结合的一抗。用 DAPI 对 DNA 进行染色。加入封片剂，盖上盖玻片。

在荧光显微镜观察过程中，入射光束首先到达激发滤光片，允许特定激发波长的光通过。当光到达二向色镜（即分光镜）时，激发光被选择性地反射至物镜，物镜将光线聚焦到样品上。

入射的激发光将荧光分子的电子激发至更高的能级。当电子回到基态时，会发射出波长更长的光，该光被物镜收集后，再反射回二向色镜。

镜面允许发射的荧光通过发射滤光片，该滤光片仅允许所需的荧光到达检测器。处理图像。分析不同颜色的荧光焦点，以可视化DNA损伤反应蛋白在DSB位点的共定位。

通过离心每份1 × 10⁵个细胞，制备两份患者样本的单个核细胞涂片。用200微升4%多聚甲醛固定细胞，固定时间为10分钟。

固定后，在摇床上用 30 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞三次，每次五分钟。然后用 200 微升 0.1% Octoxinol-9 处理细胞 10 分钟以进行通透。接着在摇床上用 30 毫升 5% 封闭液轻柔洗涤细胞三次，每次五分钟。最后用 30 毫升新鲜的 5% 封闭液封闭细胞一小时。

使用4%多聚甲醛和0.1%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇对细胞进行固定和通透处理，可清晰保留γH2AX和53BP1焦点结构。

将其中一组细胞与小鼠单克隆抗γH2AX抗体在4摄氏度下4℃孵育过夜，另一组细胞则与小鼠单克隆抗γH2AX抗体和兔多克隆抗53BP1抗体在4摄氏度下4℃孵育过夜。

强烈建议使用经过验证的抗γH2AX和抗53BP1抗体。

孵育后，在实验室摇床上用30毫升2%封闭液轻轻洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。

接下来，将第一组细胞样本与Alexa488标记的山羊抗小鼠二抗在2%封闭液中按1:500稀释后进行孵育。将第二组细胞样本与Alexa488标记的山羊抗小鼠二抗和Alexa555标记的驴抗兔二抗在2%封闭液中按1:500稀释后进行孵育。

在实验室摇床上用 30 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞三次。去除 PBS，用封片剂封片。小心地将盖玻片置于封片剂上，避免产生气泡。封片剂至少静置三小时使其完全固化，然后再通过荧光显微镜观察细胞。

最后，使用配备 DAPI、Alexa488 和 Cy3 滤光片的荧光显微镜，在 100 倍物镜放大倍数下对细胞核中的 γH2AX 和 53BP1 焦点进行分析。