一种用于检测抗体补体介导杀菌活性的血清杀菌试验

取含有针对脂多糖（LPS）的单克隆抗体的系列稀释血清样本，LPS 是革兰氏阴性菌外膜的组成成分。

介绍革兰氏阴性菌。血清抗体与细菌的脂多糖（LPS）结合。

加入补体蛋白。C1复合物结合到与脂多糖（LPS）结合的抗体上，形成具有酶活性的C1。

活化的C1裂解C4和C2，形成C3转化酶，后者裂解C3生成C5转化酶。该转化酶裂解C5产生C5b，C5b招募C6和C7。形成的复合物插入外膜，并与C8及多个C9结合，形成孔道。

外膜损伤会破坏内膜的稳定性，导致细胞裂解。

将混合物点样于琼脂平板上并涂布均匀。孵育以促进细菌生长。在平板上覆盖含有氯化三苯基四氮唑（TTC）的琼脂，TTC 可被微生物脱氢酶还原，使细菌菌落呈现红色。

菌落数量随样品稀释度增加而增多，表明抗体浓度降低时杀菌活性减弱。

首先，将样本置于56摄氏度的温水浴中孵育30分钟，以对测试样本进行热灭活。取一个检测板，在A至G行的第1至第12列中每孔加入20微升检测缓冲液。在H行的第1列和第2列中各加入20微升检测缓冲液。将每个测试样本各取30微升，重复加样至检测板的H行中。

开始对测试样品进行三倍系列稀释时，使用多通道移液器从第3H至第12H孔中各移除10微升液体。将样品转移至G行对应的孔中，并上下吹打8到10次以充分混匀。随后，从这些孔中各移除10微升液体，转移至F行对应的孔中，并同样上下吹打8到10次以混匀。继续按此方式依次进行系列稀释，直至A行。在混匀A行各孔后，从第3A至第12A孔中各移除并弃去10微升液体，使所有孔中的最终体积均为20微升。

取出一管冷冻保存的靶细菌菌种，室温下解冻。然后根据预先确定的最佳稀释倍数，将细菌悬浮于20 ml检测缓冲液中进行稀释。使用多通道移液器，向检测板的每个孔中加入10 µL稀释后的细菌溶液。

取一管冻存的幼兔补体和一管冻存的热灭活BRC。用冷水将两管样品解冻至室温。然后，将100微升热灭活的BRC与400微升检测缓冲液混合。向第1列所有孔中各加入50微升该20%热灭活BRC溶液。将1毫升天然BRC与4毫升检测缓冲液混合。向第2至第12列的所有孔中各加入50微升该20%混合液。将板置于板式摇床上，轻轻振荡10至15秒，使检测板中的溶液混匀。

将检测板放入微生物培养箱中孵育两小时。同时，取下两个LB琼脂平板的盖子，将平板正面朝上置于生物安全柜中干燥40至60分钟。孵育完成后，将检测板转移至湿冰上，继续孵育10至20分钟以终止反应。使用12通道移液器混匀H行各孔中的液体，并取10微升反应混合物点样到LBA平板底部。立即倾斜平板，使液滴沿表面扩散约1.5至2厘米。

按照上述方法依次处理 G、F 和 E 行，将菌液点在上一行的上方。将 LBA 平板在室温下孵育，直至溶液被 LBA 平板吸收。然后盖上平板盖，将平板倒置转移至微生物培养箱中，过夜培养。

第二天，向每个LBA平板中加入25 ml含100 µg/mL TTC和0.1%叠氮化钠、温度为55 °C的上层琼脂。在37 °C下孵育2小时，使存活的细菌形成红色。然后使用数码相机拍摄平板图像。将图像传输至计算机，并按照文本方案中所述步骤，使用美国国家标准与技术研究院（NIST）集成的菌落计数软件分析图像。