利用等温微量热法进行代谢谱分析以确定新型天然产物的杀菌或抑菌效应

了解新型抗菌化合物的作用机制是一项重要但困难的任务。该方法可深入揭示此类作用机制，且易于实施。该技术能够以非侵入性方式实时观察抗菌效果，从而实现对样品的进一步分析。

尽管掌握微生物学技术是实验的前提条件，但该实验本身易于操作。初次进行微量热法实验时，务必仔细进行数据分析。首先使用分光光度计在600纳米波长下测定过夜培养物的光密度。

将菌液稀释至每毫升新鲜MHB培养基中含有5 × 10⁵ CFU（菌落形成单位）的浓度，并向每支含有目标浓度抗生素的1.5 mL离心管中加入150 µL菌液。随后通过涡旋振荡使化合物与菌液充分混合。为制备插入物，将120 µL的每种细菌-抗生素混合液分别加入48孔板相应孔中的独立塑料插入物内，并使用镊子将所有钛制小管放入支架中。

轻柔地将插件转移至支架板中的钛管内，并将钛盖松松地盖在所有管子上。当所有插件均转移完毕后，将支架放置于样品站的指定区域，并使用设定为40厘牛·米的扭矩扳手拧紧所有管盖。在系统软件中，启动新实验，并将样品插入臂从仪器中缩回。

将杯架放置在桥架上，使第八列对准样品插入孔，并轻轻将杯架推入一号位置的仪器中。等待10分钟，待系统稳定后，对实验孔进行标记。接着，推动样品插入臂，直至杯架到达二号位置。

待系统稳定20分钟后，将样品插入臂推至位置3，再将样品插入臂缩回至运行位置。在软件中高亮所有孔，选择“反应开始”，然后运行实验，直至热释放读数稳定回到零。分析结束后，选择“停止”。

软件随后会询问您是否确认。请选择“是”，并保存实验以进行数据分析。然后将样品插入臂完全插入仪器中，并启动磁铁以取回杯架。

为分析数据，打开软件并选择“打开实验”。在弹出窗口中，选择目标实验并点击“打开”。点击“全选”并定义基线，以对每个位置的数据进行归一化处理。

在弹出窗口中，选择迟滞期中超过 30 分钟的时间段。选择后，基线将以绿色显示在热谱图中。关闭定义基线部分窗口，然后点击保存并关闭软件。

接下来，打开基于网页的 SymCel 量热分析应用程序。单击“浏览”以上传目标文件并选择实验。系统将自动计算 32 个样品的代谢参数。

要将热流数据拟合到Gompertz和/或Richards生长模型，请点击生长函数。生长模型将在累积部分显示，以便与流动部分中的原始数据进行比较。如需下载计算得到的参数，请点击下载参数，选择文件保存位置，然后点击保存。

该文件将被导出至电子表格以进行进一步分析。此处显示的是通过将鲍曼不动杆菌 DSM-30008 暴露于连续稀释的环丙沙星所获得的热图谱。0.005 至 0.1 微摩尔浓度范围对鲍曼不动杆菌的生长和代谢影响较小。

然而，用 0.5 微摩尔环丙沙星处理细胞会导致滞后期持续时间显著延长，并使最大热流降低。这两个变化共同影响了达到峰值的时间，导致其延长约六小时。在该图中，累积释放的热量随时间变化，每种浓度的影响通过斜率的倾斜程度来反映。

通过量化热图斜率，可计算出在环丙沙星存在条件下鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的最大代谢速率，同时观察到经0.5微摩尔环丙沙星处理的细胞其代谢速率相应下降。利福平处理对鲍曼不动杆菌DSM-30008的热图具有显著影响，也观察到热释放明显减少，这与代谢活性的降低相关。

注意所有测试浓度下达到峰值时间的延长，以及由于各浓度斜率降低所导致的代谢速率下降，这通常归因于杀菌效应。为确保最佳结果，在转移样品时应使用反向移液技术，并防止插入物侧壁残留额外液体，同时确保盖子已正确关闭。