人肠上皮类器官模型中坏死性小肠结肠炎的诱导

获取源自人小肠组织的隐窝——含有干细胞和多种类型上皮细胞的管状凹陷结构。

将肠隐窝加入预冷的基底膜基质中。

将此混合物转移至多孔板中，形成一个三维圆顶结构。

加入培养基并进行孵育。

干细胞自我组织、增殖并分化为多种类型的肠细胞，形成肠类球体。

随着时间推移，肠球体逐渐成熟为类肠器官——一种三维的、可自我更新的结构，类似于肠道隐窝。

将脂多糖（LPS，一种细菌内毒素）加入含有肠类器官的孔中，并进行孵育。

LPS分子与类肠体中的Toll样受体结合，启动促炎反应，导致活性氧物质的积累。这会引发一系列事件，最终导致细胞凋亡。

因此，肠类器官的完整性受到破坏，导致脂多糖（LPS）侵入管腔，进一步加剧炎症反应。

这模拟了早产儿肠道中发生的坏死性 小肠结肠炎，一种严重的肠道炎症。

在手术室采集样本时，将人小肠组织样本置于冰冷的DPBS中。用冰冷的DPBS冲洗样本，直至去除血液和粪便残留物。

将标本保存在 RPMI 1640 培养基中，置于 4 摄氏度条件下，直至准备进行隐窝分离。准备操作时，再次检查以确保标本中无粪便和血液残留。使用精细解剖剪去除多余的脂肪组织以及手术夹和缝合钉。称量标本，选择约 0.75 至 2.5 克重的组织块。

接下来，将组织切成0.5厘米大小的片段，并放入含有30毫升螯合缓冲液#1的离心管中。在4°C下以低速振荡15分钟。然后，通过100微米细胞滤筛过滤组织，弃去滤过液。

将过滤后的组织加入含有30毫升螯合缓冲液#2的离心管中。在4摄氏度下以低速振荡15分钟。用100微米滤器过滤组织，并弃去滤过液。

此后，将500微升基底膜基质置于冰上解冻，以备后续使用。取部分组织加入含有10毫升冷DMEM的50毫升锥形管中，手动剧烈振荡10秒。将此悬液经100微米细胞滤网过滤，收集滤过液，并将该管置于冰上保存。

取部分组织加入另一个含有 10 毫升冷 DMEM 的 50 毫升锥形管中，用手剧烈震荡 10 秒。将此悬液通过 100 微米细胞筛过滤，收集滤过液。

重复此过程两次，共得到四个含有滤过液的锥形管，分别标记为一至四。然后，将一号管中的溶液通过100微米细胞滤筛过滤，并将滤过液转移至另一个同样标记为一号的15毫升锥形管中。对二至四号管重复此操作。

将15毫升离心管在4°C条件下以200 × g 离心15分钟。在超净工作台中，移除每根离心管中的上清液并弃去。避免扰动紧邻沉淀物上方的组织絮状物，即使这意味着需保留部分上清液。在每根离心管中，用移液器缓慢吹打沉淀物与残留上清液，使其充分混匀。

将每根试管中的混合物转移至一个2毫升的锥形管中，以200 × g离心 g 4℃下孵育20分钟。随后弃去上清液，将沉淀物重悬于500微升预融化的基底膜基质中。

使用预冷的移液枪头将 50 µL 该悬浮液加入 24 孔板中每个孔的中央位置。样品应呈现圆顶状。重复此加样过程 9 次，共填充 10 个孔。

将24孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以使基质胶聚合。随后，向每孔加入500 µL完全人源类肠道培养基。在相同条件下继续孵育，并确保每两天更换一次培养基。