使用流式细胞术检测玻璃连接蛋白与细菌表面的结合

0 次观看3:05 分钟 • July 8th, 2025

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取含有野生型和突变株的流式细胞仪管 流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌,类型 f.

用移液器吸取含有阻断蛋白和玻璃连接蛋白的缓冲液。孵育。

封闭蛋白可减少细菌表面的非特异性相互作用,而玻璃粘连蛋白分子则结合于野生型细菌表面的玻璃粘连蛋白结合蛋白H上。在突变菌株中,由于缺乏蛋白H,玻璃粘连蛋白无法结合。

离心。去除未结合的玻璃连接蛋白和封闭蛋白。

加入含有抗连蛋白一抗的缓冲液,该抗体可特异性结合于野生型细菌表面附着的连蛋白。

接下来,加入荧光标记的二抗,该抗体可结合在连结素上的初代抗体,从而促进连结素的检测。

离心。去除未结合的二抗。用缓冲液重悬细菌。

通过流式细胞术检测细菌表面的玻璃连接蛋白结合情况。

比较野生型和突变株的荧光信号。野生型细菌中荧光信号的偏移表明玻连蛋白与细菌表面结合。

为进行流式细胞术,用含有250纳摩尔纤连蛋白的50微升封闭缓冲液重悬细菌沉淀。然后在室温下静置孵育1小时,不振荡。孵育结束后,在3,500 × g 离心5分钟,使细菌沉淀。随后使用PBS洗涤沉淀,重复三次,每次均采用相同的离心步骤。

洗涤后,将50微升以PBS/BSA按1:100稀释的一抗——羊抗人连环蛋白多克隆抗体加入细菌沉淀中,在室温下孵育1小时。随后用PBS洗涤细菌三次,以去除未结合的抗体。

接下来,向沉淀中加入50 µL含异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊多克隆抗体的PBS/BSA溶液,在室温避光孵育1小时。最后,经过三次洗涤步骤后,用300 µL PBS重悬细菌沉淀,并进行流式细胞术分析。

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最后更新:22 八月 2026