使用电化学发光法检测人胰岛自身抗体

为了检测胰岛自身抗体（1型糖尿病的生物标志物），取人血清样本并加入乙酸以抑制干扰成分。

孵育后，加入碱性缓冲液以中和酸。

将处理后的血清转移至多孔板中，该多孔板含有包括生物素标记的捕获抗原和钌标记的抗原在内的多种人胰岛自身抗原混合物，每种抗原的浓度均为该检测的最佳浓度。

阳性样本中的胰岛自身抗体连接了钌标记的抗原与生物素化的捕获抗原，形成抗原-抗体复合物。

将混合物转移至已用封闭剂预处理并配有工作电极和对电极的链霉亲和素包被电化学发光板中。

孵育以使生物素化复合物与结合的链霉亲和素发生相互作用，然后洗涤。

加入含有三丙胺（TPA）的缓冲液。

在电化学发光仪器中，电极间施加电压会引发钌和三丙胺（TPA）的氧化反应，生成TPA自由基。

TPA自由基激发钌配合物，使其在回到基态时发射光子。

阳性样本中出现高化学发光信号表明存在胰岛自身抗体。

将人胰岛自身抗原与生物素或磺化标签按1:5的摩尔比在离心管中混合，并用铝箔包裹离心管，因为这两种标签均对光敏感。然后在室温下孵育1小时。在此期间，当孵育进行时，用两倍体积的磷酸盐缓冲液预处理离心柱。

然后，每次以 1,000 × g 离心柱子 2 分钟。接着，将自身抗原标签混合物在旋转柱中以 1,000 × g 离心 2 分钟。然后，分装并将其标记的抗原储存在 -80 °C。

接下来，根据棋盘式滴定实验确定的生物素磺化标签标记抗原的合理浓度，为每块96孔板的抗原缓冲液配制3毫升抗原溶液。

然后在每个孔中加入 4 µL 血清，并用 1 倍磷酸盐缓冲液调整终体积至 20 µL。接着，向每个孔中加入 20 µL 标记抗原溶液，用封口膜覆盖酶标板以避光。随后，将酶标板置于摇床上，室温孵育 2 小时。

摇床停止后，将培养板置于冰箱中4摄氏度条件下静置18至24小时。随后，为每个样品将15 µL血清与18 µL 0.5 M乙酸混合，并在室温下孵育45分钟。

根据棋盘式实验的结果，使用合理的生物素磺化标签标记抗原浓度来配制抗原溶液。

然后，向新的 PCR 板的每个孔中加入 35 微升抗原缓冲液。在血清混合物的孵育即将结束前，沿抗原板每个孔的孔壁加入 3.8 微升 pH 为 9 的 1 摩尔 Tris 缓冲液。

孵育结束后，迅速将每孔中经乙酸处理的血清各25微升转移至抗原板中，并轻轻振荡混合。然后用封板膜覆盖PCR板以避光，于室温下置于摇床孵育2小时。完成后，将板转移至4摄氏度冰箱中，继续孵育18至24小时。

从4摄氏度的冰箱中取出链霉亲和素包被板，使其升至室温。当链霉亲和素包被板达到室温后，向每孔中加入150微升3%的阻断剂A，用密封膜封住PCR板，然后在冰箱中孵育过夜。

第二天，从冰箱中取出链霉亲和素包被板，弃去孔中的缓冲液。然后将板倒置在干燥的纸巾上，使残留的缓冲液被吸收，从而干燥板孔。接着，每孔加入150 µL 1倍PBST缓冲液，连续洗涤三次。

接下来，将30 µL血清抗原孵育液加入链霉亲和素包被的微孔板的每个孔中，并用铝箔覆盖微孔板以避免光照。然后将微孔板置于室温摇床上孵育1小时。1小时后，弃去微孔板中的血清抗原孵育液，每孔加入150 µL 1倍PBST缓冲液，洗涤3次。洗涤结束后，每孔加入150 µL读板缓冲液，用于酶标仪读数。