利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

本方案可使我们监测人类组织（如β细胞）中的内源性线粒体自噬复合物，从而促进在具有重要转化相关性的组织中开展线粒体自噬研究。该技术的一个优势在于能够体内可视化那些来源稀少或样本量较小的组织中的重要线粒体自噬复合物。根据标准方案分离后，在37摄氏度下，将四至六个×10³个人类胰岛当量组织置于10毫升完全胰岛培养基中培养至少一天。

第二天，在三倍放大倍数下使用解剖显微镜对培养物中的人胰岛进行单个计数。每种处理或实验条件下挑选40个胰岛，放入含有胰岛培养基的1.5毫升离心管中。通过离心沉淀胰岛，并将沉淀重悬于1毫升添加了50微摩尔PR619的磷酸盐缓冲液（PBS）中。

倒置离心管，并通过离心进行第二次洗涤，使用新鲜的PBS缓冲液并加入去泛素化酶抑制剂。第二次离心后，在37摄氏度条件下，加入125微升含抑制剂的0.25%胰蛋白酶消化液，孵育3分钟，并定期轻柔吹打使胰岛组织解离为单个细胞。孵育结束后，加入1毫升预热至37摄氏度并添加PR619的胰岛细胞培养基以终止反应。

通过离心法用新鲜 PBS 加抑制剂洗涤胰岛两次，每次洗涤后收集胰岛。第二次洗涤后，将解离的胰岛重悬于 150 µL 新鲜 PBS 加抑制剂中。为了使单个胰岛贴附并固定，将细胞悬液通过细胞离心涂片机点样至表面带电荷的磨砂载玻片上，并用疏水笔标记细胞区域的轮廓。

然后在室温下用 4% 多聚甲醛和 PBS 固定圈选的细胞，持续 15 分钟。对于胰岛样本的免疫组织化学分析，在室温下用 PBS 洗涤细胞两次，每次五分钟，随后在室温下用 10% 驴血清、PBS 加 0.3% 去垢剂封闭非特异性结合位点，持续一小时。封闭孵育结束后，在 4°C 条件下，将细胞与抗泛素特异性肽酶 8 的小鼠一抗、抗神经调节蛋白受体降解蛋白-1 的兔一抗，以及一种不在小鼠或兔体内产生的、用于 β 细胞鉴定的特异性标记物共同孵育过夜，以避免干扰邻近连接实验信号。

第二天早晨，在摇床上用 PBS 洗涤样品，每次五分钟，共洗涤两次。将抗山羊 Cy5 二抗加入新配制的邻位连接探针反应液中。第二次洗涤后，每份胰岛样品加入 20 微升探针溶液，并用塑料膜覆盖载玻片，于 37 摄氏度孵育一小时。

孵育结束后，在摇床上用缓冲液A洗涤细胞，每次5分钟，共洗两次，随后每张载玻片加入20微升新鲜配制的连接反应液（其中添加0.25单位/微升的连接酶），在37摄氏度下孵育30分钟。连接反应结束后，用缓冲液A洗涤细胞两次，每次2分钟。每份样本加入20微升含有聚合酶的扩增溶液，于37摄氏度孵育100至120分钟。

为进行成像，将样品在新鲜的缓冲液A中于摇床上洗涤两次，每次10分钟，随后在0.1×缓冲液B中于摇床上洗涤一次，持续2分钟。最后一次洗涤后，加入含DAPI的封片剂一滴，用刀片轻轻按压盖玻片覆盖每个样品，以排除气泡。然后用透明指甲油在盖玻片边缘进行密封。

为成像样品，将载玻片置于可捕获多个焦平面的显微镜载物台上，选择100倍放大倍数。将Z轴层厚设置为约0.45 µm，并设定适当的染料、复染剂以及活细胞信号的激发和发射参数。获取至少九个不同焦平面的图像。

为确保荧光图像的背景信号和杂散光降至最低，使用选定的标准图像处理软件，采用二维去卷积最近邻算法对图像进行处理。为量化邻近连接测定相互作用，打开 ImageJ 并载入邻近连接测定图像。从第一张清晰对焦的图像开始，点击“图像”，选择“调整”和“阈值”。

调整阈值以去除所有非特异性的邻近连接实验信号，并记录阈值调整参数，以便在整个分析过程中保持信号的一致性。点击“Process”（处理），选择“Binary”（二值化）并点击“Make Binary”（生成二值图像）。确认“Size”（大小）设置为从零到无穷大，“Circularity”（圆度）设置为从0到1，“Show”（显示）设置为“Outlines”（轮廓），并勾选“Display results”（显示结果）和“Clear results”（清除结果）选项框。

在电子表格中记录所分析颗粒的数量，并注明样品及Z轴层析位置。然后点击“分析”→“分析颗粒”以测量颗粒。当该样品所有在焦的Z轴层析图像均分析完毕后，将电子表格中该样品的颗粒总数汇总，用于量化相互作用的总数量。

邻近检测中所使用的抗体针对配体具有特异性，且未表现出任何交叉反应。如图所示，分散方案在显微镜视野中高效地获得了可用于下游分析的单个细胞，且在原代人胰岛细胞中，β细胞染色在邻近连接检测染色后仍得以保留。通过所展示的技术，可确定在棕榈酸刺激48小时后，神经调节蛋白受体降解蛋白-1（neuregulin receptor degradation protein-1）与泛素特异性蛋白酶8（ubiquitin-specific peptidase 8）之间的相互作用减少，凸显了该检测方法在评估致糖尿病刺激后关键内源性线粒体自噬因子方面的可行性。

高效且温和地分散人胰岛对于确保后续正确细胞群体的定量至关重要。PLA 可用于评估人胰岛样本中重要的线粒体自噬复合物，从而分析线粒体自噬及具有重要生物学意义的人类患者样本，推动糖尿病研究领域的发展。