评估病毒衍生肽修饰抗体偶联物的细胞内分布

从贴壁的人类成红血球细胞开始。

引入源自病毒的、经肽修饰的抗体偶联物。这些偶联物包含来自病毒的核定位信号序列（NLS）以及胆酸残基。

孵育期间，抗体偶联物与细胞表面受体相互作用，并在内体中内化。

该偶联物中的胆酸有助于逃逸内体区室，从而实现细胞内积累，而转运蛋白和核定位信号（NLS）则促进其向细胞核的定位。

加入含有胰蛋白酶和EDTA的缓冲液，以解离细胞并去除表面结合的偶联物。

加入含血清的培养基以抑制胰蛋白酶活性。

离心收集细胞；固定并透化细胞。

加入远红荧光染料标记的二抗，使其与定位的偶联物结合，然后洗涤。

使用细胞核染色染料进行处理。

在共聚焦显微镜下观察，并在不同平面深度采集图像。

图像处理后，细胞在细胞质和细胞核内显示出微小的绿色荧光焦点，证实了抗体偶联物的细胞内分布。

用200纳摩尔的7G3-胆酸-抗体偶联物处理靶向TF-1a细胞。同时设置经修饰的对照单克隆抗体处理的细胞。将5 × 10⁶个抗原阳性细胞与偶联物在37摄氏度下孵育一小时。随后移除上清液，并用1毫升预冷的PBS洗涤细胞三次。

加入新鲜培养基，在37摄氏度下继续孵育细胞1小时。接着，加入含有0.25%胰蛋白酶和EDTA的0.5毫升PBS，于37摄氏度孵育最多30分钟。然后，使用含10%胎牛血清（FBS）的1.5毫升RPMI-1640培养基中和胰蛋白酶。

将细胞在500 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，用0.5毫升预冷的PBS洗涤细胞三次。向细胞中加入0.5毫升含1% PFA和1%蔗糖的PBS溶液，冰上放置30分钟以固定细胞。

然后用 0.5 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞三次，于 250 × g 离心 5 分钟。接着向细胞中加入含 0.15% Triton X-100 的 PBS，冰上孵育 5 分钟以进行透化处理。随后用预冷的 PBS 洗涤细胞，并重复离心步骤。

将细胞重悬于 0.1 毫升含有 2 微克/毫升 AlexaFluor 647 标记的抗小鼠 Fc 二抗的 PBS 中，在室温避光孵育 1 小时。以 250 × g 离心 5 分钟，用 0.5 毫升冰冻 PBS 洗涤细胞 3 次。

然后将细胞重悬于 0.5 毫升 PBS 中。向细胞中加入终浓度为 10 微克/毫升的碘化丙啶。接着，用封片剂将 1 × 10⁵ 个细胞滴加到玻片上，再用盖玻片封片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜，配备 Plan Apo 60X 油镜（数值孔径 1.42）观察细胞。

使用488纳米氩离子激光器，并将光谱扫描棱镜设置为600至650纳米，检测PI荧光。对于AF 647荧光，使用633纳米氦氖激光器，并将光谱扫描棱镜设置为650至700纳米。依次采集P1和AF 647的图像，图像分辨率为1024×1024像素，沿整个细胞厚度以0.5微米间隔进行扫描，每线平均采集2次。图像以Z轴投影形式呈现。

为了分析细胞，评估并记录细胞质内的荧光是成簇且靠近细胞表面，还是弥散且均匀分布。同时，评估每个细胞的相对荧光强度。