构建双人源化BLT（骨髓、肝、胸腺）小鼠模型

从一只缺乏免疫细胞的麻醉免疫缺陷小鼠开始。

给予小鼠亚致死剂量的X射线照射，以清除骨髓中已有的干细胞。

解剖小鼠，并将人胎儿肝脏和胸腺组织的碎片移植于肾脏与其被膜之间。

缝合切口。

植入的肝脏和胸腺组织生长，形成类器官，即类似于器官的细胞聚集体。

复苏后，将人造血干细胞（HSCs）注入尾静脉。

注射的造血干细胞迁移至胸腺类器官和骨髓，并分化为多种人类免疫细胞。

为小鼠提供添加抗生素的水，以清除其体内已有的肠道微生物。

使用口腔管将人粪便微生物直接引入小鼠肠道，以促进微生物定植。

这导致了双人源化BLT小鼠模型的建立，该模型具有人源免疫系统和肠道微生物。

将肝脏和胸腺组织植入左肾包膜时，首先将小鼠放入通风橱中。在手术当天，以每克体重12厘戈瑞（centi-gray）的剂量对小鼠进行全身亚致死剂量照射。在确认小鼠达到适当麻醉深度后，剃除每只小鼠左侧外侧和内侧区域的毛发。在动物眼睛上涂抹眼膏，并根据需要佩戴耳标，随后使用碘伏和70%异丙醇交替擦拭三次，对皮肤进行消毒。

皮肤消毒准备完成后，用镊子将一块 1 至 1.6 毫米³ 的人胎儿肝脏组织碎片装入套管针中，随后放入一块 1 至 1.6 毫米³ 的人胎儿胸腺组织碎片。用镊子提起皮肤，使用手术刀在皮肤上做一个小的纵向切口。在小鼠左侧将切口延长至 1.5 至 2 厘米，用镊子提起肌肉层。用剪刀纵向切开肌肉层，根据需要延长切口，以暴露肾脏，并轻轻夹住肾脏周围脂肪组织。

使用手术刀在肾包膜的后端做一处1至2毫米的切口，然后将预装好的套管针平行于肾脏长轴缓慢插入切口。松解肾包膜与肾脏之间的组织，将肾脏和肠管复位至正常位置。随后，使用缝线缝合肌肉层，并用外科缝钉闭合皮肤。将小鼠放入经高压灭菌的隔离器笼中持续监测，直至完全恢复卧姿体位。手术后6小时，将小鼠置于加热灯下，并用70%异丙醇对尾巴进行消毒。

每只动物通过一个扩张的尾静脉注射 1.5 至 5 × 10⁵ 个 CD34 阳性的、从人胎儿肝脏组织分离的造血干细胞，体积为 200 微升 PBS。然后轻压止血，并将小鼠放回其原有笼具中。手术后 9 至 12 周，使用合适尺寸的塑料锥形固定器固定一只人源化小鼠的一条腿，用 70% 异丙醇喷洒该腿内侧。在采样部位涂抹抗生素和止痛药膏。

使用25号针头以90度角刺穿隐静脉，将50至100微升血液收集至EDTA包被的采血管中。当获得合适体积的血液后，在将小鼠放回笼子前，用无菌纱布对采血部位施加压力以止血。随后，利用采集的外周血样本，通过流式细胞术检测人免疫细胞重建水平，所用抗体包括抗人CD45、CD3、CD4、CD8、CD19以及抗小鼠CD45。

采集新鲜粪便样本时，将独立的灭菌纸袋放入生物安全柜中，每只小鼠放入一个纸袋，直至每只动物排便。随后将小鼠放回笼中，使用无菌镊子将每份粪便样本分别转移至一个1.5毫升离心管中，每只小鼠对应一管，用于在-80摄氏度条件下保存。

在14天的抗生素治疗结束时，将小鼠的饮用水更换为高压灭菌的无菌水，并将小鼠转移至新的高压灭菌笼具中。在停止抗生素后的24小时和48小时，于厌氧环境下在厌氧培养箱中采集准备好的粪便微生物移植材料来源，并对样本进行分装。

进行粪便移植时，给予200微升粪便微生物移植材料 通过 通过口服灌胃给予每只实验动物，并将任何剩余的解冻材料涂抹在人源化小鼠的毛发上或笼具垫料中。