使用亲和层析纯化自组装蛋白质纳米颗粒

取表达带有聚组氨酸标签的重组自组装蛋白纳米颗粒的基因工程菌悬液。

超声处理以释放细胞内组分。

离心以收集含有蛋白质纳米颗粒的上清液。用不含咪唑的缓冲液稀释。

取一个含有固定化镍阳离子琼脂糖珠的亲和层析柱。

加入低咪唑浓度的缓冲液以平衡柱子。

将细菌裂解液加入到层析柱中。

在运行过程中，蛋白质纳米颗粒上的多聚组氨酸与镍阳离子强烈结合。

与此同时，细菌脂多糖和其他蛋白质等污染物与柱子的结合较弱。

用含有低浓度咪唑的缓冲液洗涤，以去除弱结合的蛋白质。

加入异丙醇以去除脂多糖，然后洗涤。

接下来，引入一种含有中等浓度咪唑的缓冲液。咪唑会与组氨酸竞争结合镍阳离子，从而释放已结合的蛋白质纳米颗粒。

接下来，加入含有高浓度咪唑的缓冲液，以彻底洗脱蛋白质纳米颗粒。

收集纯化的蛋白质纳米颗粒用于后续应用。

对于表达六螺旋束SAPN的收获E. coli的裂解，使用输出功率为150瓦的探头，在冰上用40毫升不含咪唑的缓冲液重悬菌体沉淀后，进行超声处理5分钟，每次超声4秒，间隔6秒休息。

离心细胞裂解液以获得澄清的上清液，并将上清液转移至一个无菌的150毫升锥形瓶中。然后用新鲜的不含咪唑的缓冲液定容至最终体积100毫升。

为了分离目标蛋白，打开FPLC软件并点击 新 方法 选项。在 方法 设置 菜单，打开 柱 位置 下拉菜单并选择 C1 端口 3. 在 如图所示 由 技术 下拉菜单，选择 亲和力 在 柱 类型 下拉菜单，选择 其他 HisTrap HP, 和 五 毫升 柱体积和压力盒将自动设置为适当值。

单击方法概述，然后从箭头旁边的阶段库弹出菜单中，将平衡和上样按钮、三个柱洗涤按钮以及洗脱按钮拖出，之后关闭阶段库菜单。单击平衡，并将表中所列数值设置为：初始缓冲液 B 为 4%，最终缓冲液 B 为 4%，柱体积为 5。

点击 样本 应用。 在 样本 加载中 框，单击 放射 按钮用于 注射 样本 在 柱 与 样本 泵 并确认其旁边的方框已勾选 使用 流式 速率 从 方法 设置 在……中进行检查 样本 注射 与 系统 泵 盒 改变 体积 盒子 值 至100毫升和 组分 采集 示意图 至 启用。

取消勾选 使用 组分 大小 从 方法 设置 盒子并更改组分体积至四毫升。点击第一个 柱 洗涤 按钮。将表格中列出的值分别设置为初始缓冲液B，4%；终末缓冲液B，4%；柱体积，10。点击 组分 采集 示意图 启用 框并取消勾选 使用 组分 大小 用于 方法 设置。将组分体积更改为四毫升，然后点击第二个 柱 洗涤 按钮

将表格中的数值设置为初始缓冲液B，0%，终末缓冲液B，0%，柱体积，5。点击 组分 样本采集 示意图 启用 框并取消勾选 使用 组分 大小 从 方法 设置 将馏分体积改为4毫升，然后点击第三次 柱 洗涤 按钮。在表格中设置以下数值：初始缓冲液B，0%；终末缓冲液B，0%；柱体积，10。点击 组分 采集 示意图 启用 按钮并取消选中 使用 组分 大小 用于 方法 设置 然后，将组分体积更改为 4 毫升。

单击洗脱按钮，然后右键单击表格中的信息。在弹出菜单中，单击删除步骤，并将等度梯度按钮两次拖动到表格中，以生成两条记录。将第一条记录的参数设置为：初始缓冲液B，30%；最终缓冲液B，30%；柱体积，10。

将第二项的值设置为初始缓冲液B，100%，终末缓冲液B，100%，柱体积，10。点击组分收集方案启用按钮，并勾选使用组分体积进行方法设置复选框。然后，点击另存为并命名文件为纯化。

将FPLC的泵A管路放入不含咪唑的洗涤缓冲液中，将泵B管路放入500毫摩尔咪唑缓冲液中。将样品泵管路放入100毫升样品中，运行纯化程序。当需要60%异丙醇洗涤时，暂停程序，将泵管路从不含咪唑的洗涤缓冲液移至60%异丙醇洗涤液中，然后重新启动程序。洗涤结束后，再次暂停程序，将泵A管路移回不含咪唑的洗涤缓冲液中，然后重新启动纯化程序。