脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

本方法的总体目标是对神经元及其轴突投射进行标记，以追踪它们与特定目标脑核或起源脑核之间的连接关系。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如大脑不同区域或神经元亚群之间的连接模式，以及这些连接在特定神经环路中的功能意义。该技术的主要优势在于示踪剂注射过程中具有更高的靶向准确性。

通过使用基本的光学设备观察荧光标记的脑核，即可实现这一目标。该方法的另一个优点是，可对在神经元启动子调控下表达荧光蛋白的小鼠种群进行非侵入性基因分型。在对幼鼠进行基因分型时，使用具有合适激发波长的激光笔检测相应荧光标记物的表达情况。

同时，佩戴可阻断激发波长但透过发射波长的滤光护目镜。将激光对准待处理幼鼠的头部后方或脊髓部位。注意避免激光照射到幼鼠的眼睛，并尽量缩短激光暴露时间。

激发后的荧光标记应可通过皮肤观察到。当小鼠年龄较大时，可识别所获取组织中的单个神经元。在麻醉小鼠并确认反射消失后，去除颅骨上方的皮肤，沿头部后侧至颅骨中段切开皮肤。

对于超过一个月龄的更年老小鼠，可通过动物的眼睛观察到荧光。接下来，使用预冷的 PBS 经心脏灌注标记阳性的动物，采用 30 号针头，灌注 5 到 10 分钟后，大部分血液将被清除。然后取出脑组织，并分离出目标区域。

此处，位于脑腹侧区域的两个显著膨大部分构成的斜方体，即为感兴趣的区域。斜方体腹侧核（VNTB）的实验起始于将离体的脑区感兴趣部位转移至盛有充氧解剖液的培养皿中。随后，使用30号注射针头固定脑组织，使注射区域朝上，便于操作。

注射时使用经过三到四次拉制循环制成的Bo硼硅酸盐玻璃注射移液管。用以下溶液填充移液管：与Alexa FLUORA 4 5 55偶联的霍乱毒素B亚基，主要用于逆行运输。

使用激光指示器和注射移液管，将所有设备安装并准备就绪后，开始将光束对准需要注射的标记脑区或细胞。通过带通滤光镜观察视野，以确定需用注射移液管靶向的神经元。使用显微操作器将移液管定位至目标区域。

然后使用压力注射仪，设置为在15 PS下释放持续50毫秒的脉冲，将示踪物质注射2到10次。每次脉冲之间间隔10至15秒，以便注入的染料充分扩散。在注射四乙基罗丹明时，使用刺激电极施加TTL脉冲，对相应区域进行电刺激。

确保电极在浴液中接地。以每个50毫秒持续时间、间隔50毫秒的8个8伏TTL脉冲进行刺激。在数分钟内对该区域施加10至20次脉冲重复刺激。

脑核的大小、神经元密度和细胞类型各不相同。这意味着可能需要调整压力和/或电脉冲的持续时间及次数，以获得特定脑区的最佳标记效果。使用激光和护目镜检查荧光示踪剂信号。

染料应被细胞吸收，并在注射区域周围扩散。注射后，将脑干置于含氧的人工脑脊液中，在室温下孵育1至4小时。孵育期间需持续供氧，然后用4%多聚甲醛固定组织。

次日，在4°C条件下用PBS孵育过夜后，可对组织进行切片，并向斜方体腹侧核（VNTB）进行梯度注射。使用四乙基罗丹明葡聚糖示踪显示，VNTB发出的投射延伸至斜方体内侧核（MNTB）。随后向MNTB注射霍乱毒素亚单位B，该示踪剂逆向标记了VNTB。

更详细地说，接下来似乎出现了标记的甘氨酸能肠源性VNTB细胞的胞体。将逆行标记物葡聚糖三（dextrin tri）注射到MNTB中。与CTB标记的点状模式不同，葡聚糖三标记呈密集状，类似高尔基（GOGI）染色模式。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何更准确地标记神经元及其突起。一旦熟练掌握，该技术可帮助您识别参与特定神经环路的脑区及神经元亚群，且注射操作可在约30分钟内完成。该方法可轻松与其他技术（如免疫组化或脑组织透明化）结合使用，以进一步探究神经投射及其他神经结构的形态、方向性或功能特性。