微加工柱阵列检测器（mPADs）：一种分离力学力的方法

大家好，我是Nathan Snia Decky，今天和我一起的有Wes Ligan、Robbie Desai以及Mike Yang。我们来自宾夕法尼亚大学Chris Chen实验室。在本视频中，我们将介绍一种利用微加工柱阵列来测量细胞吸引力的方法。

牵引力由肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用产生，在生理过程中发挥着重要作用。在发育过程中，这些力使细胞能够从一个位置移动到另一个位置，从而形成组织的早期结构。此外，牵引力还参与愈合过程，因为它们对于伤口闭合以及白细胞在体内的迁移和爬行至关重要。

但遗憾的是，在癌细胞转移或血管向肿瘤生长的情况下，这些相同的力可能对我们的健康造成损害。因此，目前能够用于定量测量这些牵引力的方法非常有限，尤其是在单个细胞的微米和纳米尺度上。目前大多数体外研究细胞的常用方法都使用玻璃底培养皿或聚苯乙烯培养皿，但这些基底非常刚性，无法让我们实际测量细胞所产生的牵引力及其引起的形变。

因此，如果没有某种物理读出手段，要理解牵引力的潜在机制一直非常困难。为此，在Chris Chen的实验室中，我们开发了一种技术，能够克服这些局限性。我们的方法基于一种垂直排列的柔性悬臂阵列，其刚度和尺寸尺度使得单个细胞能够铺展在多个悬臂上，并在过程中使其发生偏转。

我们最常使用的尺寸为直径3微米、高10微米的圆柱形微柱，中心间距为9微米，呈矩形阵列排列。然而，这些尺寸可根据多种细胞研究的需求进行调整。我们首先从一个刚性硅模板开始（如图所示），然后将其转化为柔性的PDMS悬臂梁（如图所示）。

利用该技术，我们可以在显微镜下测量各个悬臂梁的偏转，并反推出产生此类偏转所需的细胞牵引力的大小和方向。我们将这些基底制成了用于微柱阵列检测器的 M 垫片，在本视频中，我们将向您展示 M 垫片的制备过程，从硅胶母模开始，经过 PDMS 复型，最终实现调制和细胞收缩力的计算。您好，我们现在位于实验室的洁净室内。

这是一个无尘且避光的环境，用于制备将作为硅模板的SU-8微柱结构。我们首先采用一片硅片，并在其表面涂覆SU-8光刻胶。SU-8是一种负性光刻胶，具有光敏性。因此，当光线透过光刻掩模照射时，会在光刻胶上形成微柱图案，进而生成三维结构，即后续用于PDMS复制的SU-8模板。

完成所有加工步骤后，晶圆将呈现如图所示的形貌，即微柱和微柱状结构已加工到晶圆上。为了制作母版，我们首先从一片洁净的硅片开始，该硅片已用臭氧处理清洗七分钟，并在120摄氏度下脱水处理30分钟。接下来，我们将SU-8 2002光刻胶旋涂到该硅片上，以形成用于微柱的极薄基底层。

由于我们将要旋涂SU-8，所以我将佩戴防毒面具，将晶圆重新装入此卡盘中，清除表面可能存在的灰尘，然后将其放置在旋涂仪上，检查是否居中，接着将SU-8 2002溶液滴加到晶圆表面，随后开始旋涂。旋涂完成后，将晶圆转移至加热板上进行软烘。

之后我们继续操作一分钟。然后将其转移至95°C的加热板上，持续两分钟。

完成后，我们将立即进行下一步操作，即在掩模对准仪中进行泛光曝光。好的，我们刚刚已在该晶圆上旋涂了SU-8，这是SU-8的第一层，现在需要对整个晶圆进行泛光曝光，以形成微柱结构的第一层基础。因此，我们需要提供70毫焦耳的曝光剂量。

因此，我们需要测量此处掩模对准仪中光的实际强度。我们将光强计放入掩模对准仪中，然后用光进行曝光。

这是紫外线光源。我们将硅片装载到掩模对准仪上，并将其放入掩模对准仪中。本次实验没有使用掩模，因此可以对整个薄膜进行曝光。

我们先打开快门，然后设置一分钟后开始曝光，接着进行曝光。一分钟后系统完成曝光，此时可以取出晶圆。接下来需要进行曝光后烘烤。

因此，我们刚刚完成了对该晶圆的曝光，接下来需要加热以促使SU-8第一层涂层发生交联反应。首先，将其置于65°C的加热板上1分钟，然后转移到95°C的加热板上加热2分钟。经过2分钟的加热处理后，关闭加热板，让晶圆自然冷却至室温，该过程大约需要30分钟。

现在，我们已将第二层SU-8旋涂到该晶圆上。接下来需要通过光刻掩模进行实际曝光。这次我们将使用紫外滤光片来屏蔽深紫外光。

这是一种可以获得的Hoya光学玻璃，但这次我们需要再次测量光强。因此，我们将使用光度计，或使用上方的滤光片来测量经过滤后的光强。然后，我们将把掩模装入掩模对准仪中。

该开关会产生真空，使掩模固定到位。然后将其放入掩模对准器中。接着将滤光片放在上面，再将我们的晶圆装入。

我们需要确保有良好的接触，因此将其向上抬起使其接触，然后开始曝光。曝光后，我们将晶圆从掩模对准器中取出。此时，我们已经得到了选择性曝光的区域。接下来将晶圆放入烘箱或热板中进行曝光后烘烤。

我们刚刚完成了PO，即最终的曝光后烘烤，现在我们将要对这块晶圆进行显影，以获得三维结构。具体操作是，我们将使用P-G-M-E-A进行显影处理，溶解掉未曝光的SU-8光刻胶。首先，将晶圆放入盛有P-G-M-E-A的第一道容器中，轻轻振荡，浸泡两分钟。

因此，我将让这个过程持续两分钟。接下来，我们将转移到第二个含有 P-G-M-E-A 的培养皿中。这一步将去除已饱和的含有 SU8 的 P-G-M-E-A。

10 秒后，将其转入异丙醇（IPA）中。这一步可洗去 P-G-M-E-A。在此步骤中放置 20 秒，同样进行轻微振荡。

然后，目前我们已有独立的柱状结构。接下来将其放入表面张力较低的正己烷中，先后在第一份和第二份正己烷中各清洗五秒钟，之后即可进行吹干。

因此，我们刚刚完成了晶圆的显影，接下来将它放置在加热板上，并缓慢升温至150°C。在此较高温度下，SU-8材料会进一步发生交联反应，从而增强其结构刚性。晶圆将在加热板上放置过夜，时间介于14至20小时之间。之后，我们将关闭加热板，使其自然冷却至室温。

因此，我们需要将这块晶圆切割成更小的尺寸。基本上，我们要切割这块硅晶圆，仅保留其中部的图案，制成一个小型芯片。最终得到的结构将类似于图中所示，之后会使用环氧树脂进行固定。

然后我们将该芯片粘接到载玻片上，如此便可提供结构支撑。切割晶圆在某种程度上是一门技术，但基本操作是使用金刚石刻划笔，从其中一个边缘开始进行。

由于晶体平面的存在，只需做一个小切口即可。这样就形成了一个裂口，然后可以用此工具轻敲，使其分离。我们可以将这一部分剥离，然后在此处进行更多切割，直到获得像这样的小型结构。接着，迅速将硅芯片放置到玻璃上，并将其固定到位，静置使其固化。

完成操作后，您将得到一个与此类似的装置。我们已将硅胶母版固定在载玻片上，接下来将对其进行氟涂层处理，以便后续从聚二甲基硅氧烷（PDMS）上顺利脱模。因此，我们将芯片放入干燥器中，然后取几滴三氯硅烷，将少量液滴加入干燥器内。

我们在通风橱内进行此操作，因为该过程会产生副产物氯化氢气体，这种气体具有较强的刺激性。请继续盖上盖子，将其连接到真空系统，然后启动真空，使材料沉积过夜，从而在整个硅片表面形成一层均匀的涂层。大家好，我是Wesley Ligan。

我是Christopher Chen实验室的研究生。目前，Nate已经向您展示了如何为我们的ED基底制作硅胶母版。然而，在使用此工具测量细胞收缩力之前，有必要首先使用弹性硅胶聚合物复制出刚性的光刻结构。

我们的首要任务是利用先前制备的硅胶母模生成一个负模板。我们使用一种称为聚二甲基硅氧烷（PDMS）的硅基弹性体来制备PDMS聚合物。现在加入固化剂，其比例为1:10。

称量好溶液后，必须充分混合PDMS聚合物与交联剂。此混合过程显然会向溶液中引入大量气泡。因此，此时必须将其敞口放置，并在真空干燥器中进行脱气处理。

当PDMS完全脱气且所有气泡均已升至表面并破裂后，即可将其从真空干燥器中取出。现在可使用该PDMS与交联剂的混合物来制备硅胶母模的负模。为此，我们使用一个派盘，并将固定好的硅胶母模置于其中心位置。

然后，我们小心地将DGA聚合物溶液倒入培养皿中，覆盖在硅片上方，尽量防止产生额外的气泡。通常情况下，我们尝试将聚合物倒至大约四分之一英寸厚。可以看出，此过程不可避免地会在混合物中引入少量气泡。

现在，我们将此培养皿放置约30分钟，以使气泡上升至表面并破裂。我们可以观察到，静置后PDMS表面仍存在少量气泡。然而，由于这些气泡位于上表面，我们可使用短暂的氮气脉冲清除任何残留的气泡。

为了充分交联 PDMS 和交联剂溶液并生成硅胶母模的刚性负模板，我们在 110 摄氏度下烘烤 20 分钟。我们可以观察到，在硅基底上方有一层薄薄的 PDMS。在将两者剥离之前，必须先切除这层薄膜。

然后我们可以移植这一顶层，并轻轻将其从硅基底上剥离。此时，我们可以将负硅基底、负PDMS基底缓慢地从硅胶母模上反向剥离。好的，操作时需固定住一端，然后轻轻将PDMS基底剥离。

可以看到，随着基底从硅胶母模上剥离，前沿逐渐向前推进。现在我们已经制备出硅胶母模的A-P-D-M-S负模，可以将其切割成四个独立的负模，用于制作最终的垫片基底。此时需要注意，切勿使用镊子或手套触碰负模基底的上表面，以免损坏表面结构。

此时，我们已从硅胶母模上制备出四个独立的负向模板，该母模包含直径为 3 微米、深度为 9 微米的孔洞。为了重建凸起的悬臂结构表面，可使用 PDI PDMS 材料在这些负向模具上再次浇铸 PDMS。但在进行此操作之前，必须先通过涂覆氟化物使这些负向模具表面不再具有粘附性。

我们在100瓦的等离子腔室中以全功率处理一分钟。待腔室抽真空后重新通入等离子气体，可产生离子气体场，刻蚀PDMS表面并使其对荧光Cy Lane分子的黏附性增强。从真空干燥器中取出负模后，可观察到非黏附性PDMS层上形成了一系列深10微米、直径3微米的微孔阵列。

为了再生长我们用于 mpad 基底的垂直悬臂结构，需要使用相同的 PDMS 混合物再次进行浇铸，从而获得一个与之前制备的硅模板完全对应的、自由站立的弹性体悬臂正阵列。该过程的第一步是将我们的非粘性负模转移至一个由 PDMS 条带和玻璃载玻片制成的安装夹具上。此装置的作用将在下一步中变得明确。

此时，可将少量已脱气的相同 PDMS 与交联剂按 10:1 比例混合的溶液滴加至各负模的上表面。仅需少量 PDMS，以避免其流至负模边缘。此时。

为了更充分地将PDMS铺展到模具的顶面，可以用镊子夹取一个模具，将其翻转，小心地与相邻的模具接触，并将PDMS均匀铺开，以完全覆盖整个基底。此步骤需格外小心，避免向顶部PDMS溶液中引入新的气泡。随后可对另外两个孔和另外两个模具重复此操作。现在，PDMS在顶面的涂层已更加均匀，可将此夹具放入真空干燥器中，进一步去除可能被困在PDMS薄膜中的气泡。

此过程通常需要约30分钟。在负模抽真空脱气的同时，我们可以清洗22乘22毫米的玻璃基底，这些基底将作为垫片的最终安装位置。该过程的第一步是使用压缩氮气吹去表面的灰尘颗粒。

我们将玻璃盖玻片暴露于气体等离子体中，这会烧蚀其表面，使其对聚二甲基硅氧烷（PDMS）的粘附性更强，以便在下一步中将PDMS粘附到盖玻片上。在让PDMS顶层与负模接触约30分钟后，并对玻璃盖玻片进行等离子体活化处理，我们便可移除模板，将已暴露于气体等离子体的玻璃盖玻片上表面与负模顶部的PDMS层接触。通常建议先将玻璃盖玻片的一边与PDMS接触，然后让盖玻片其余部分以单层（SH）方式逐渐贴合，从而使PDMS以片状均匀展开。

这有助于减少引入PDMS薄膜中的气泡。此时，我们可以用镊子轻轻按压玻璃盖玻片的上表面，挤出多余的PDMS，并将盖玻片向模板中心的PDMS十字结构推紧。这样可以防止PDMS固化过程中盖玻片发生移动。

我们对其他基底重复此操作。此时，可将整个模板转移至烤箱中，在110摄氏度下烘烤22小时。待整个装置冷却至室温后，即可取出基底，将其倒置，并小心地将负模从玻璃盖玻片上剥离下来。

必须缓慢且均匀地进行此操作，以避免压碎微柱或将微柱从玻璃基底上撕裂。我们可以看到，在剥离负模后，留下了一排排悬臂阵列，其结构精确地复制了硅母版，只是现在这些结构由柔性的PDMS弹性体构成。好的，至此我们已经向您展示了如何制备Emad基底的硅母版。

随后，我们采用复制模塑工艺，利用 A-P-D-M-S 弹性体聚合物生成一个精确的复制品，使得悬臂梁具有柔韧性，从而允许细胞铺展、收缩，并在此过程中使悬臂梁发生偏转。至此，我们的基底已准备好用于细胞培养的后续处理。现在我们已经了解了如何制备和复制模具以制造 EDS，接下来将进行若干额外步骤，以使 EDS 具备功能性，从而能够进行细胞培养，并继而分析牵引力。

但在进行之前，我们需要完成三件事。首先，我们需要使微柱的尖端具有细胞黏附性。其次，我们需要对PDMS进行荧光标记，以便于观察和分析微柱的偏转情况。

第三，我们需要使柱状结构的侧壁以及柱基对细胞呈非黏附性，以确保牵引力仅作用于柱的顶端。接下来几分钟内，我们将了解如何通过基于微接触印刷的策略来实现这些步骤。但首先，下一步是清除eds上多余的P-D-S-P-D-M-S。

正如我前面提到的，第一步是取EDS基底，West刚才已经向你们展示了如何制备并修剪多余的PDMS。这些多余的PDMS是在将玻璃盖玻片与负模接触固化后产生的，需使用锋利的剃刀刀片进行修剪。具体操作是将刀片垂直置于柱状结构边缘的基底上，然后刮除多余的PDMS。

你可以用一根手指按住盖玻片，使其保持固定不移动。最终得到的是一种已清除碎片的 M 垫基底，因而易于操作。接下来的步骤中，我们需要通过微接触印刷技术将 MPAs 印制到柱状结构的顶端，使其具有黏附性。

为了实现这一点，我们首先需要制备印章，该过程非常简单。我们只需将PDMS以1比30的比例混合（而非10比1的比例），然后倒入培养皿中，使PDMS的高度约为一厘米。

静置脱气，即让气泡上升至PDMS顶部，并将培养皿放入60°C烘箱中固化交联反应1小时。从烘箱中取出培养皿并冷却后，现在可以切割印章。同样使用这种剃刀片，只需垂直向下按压切入PDMS，直至接触到培养皿底部即可。

现在需要注意印章的方向。印章表面是聚二甲基硅氧烷（PDMS）中与培养皿底部贴合固化的一侧，以保持其平整。因此，在我切割出的这块较大的PDMS方块中，印章表面目前朝上。

现在这个印章比 M 垫片大得多，因此我将用剃刀将其裁剪至单个 M 垫片的大小，因为仅凭肉眼很难判断印章的正确方向，我将在印章背面（即非印面一侧）切出一个小切口，就像这样。然后我可以将印章从较大的基块上取下。至此，我已制备好用于下一步的 A-P-D-M-S 印章。

我们需要清洗PDMS印章。因为在切割PDMS印章的过程中，大气中的灰尘很可能已经沉降到其表面。该过程是将所需数量的PDMS印章放入此结晶皿中，并用100%乙醇充满结晶皿。

只需加入足量的乙醇以浸没印章表面即可，乙醇的具体加入量并不重要。然后将结晶盘放入振荡器中，对印章超声处理五分钟。五分钟后，我们将完成印章的灭菌，并在无菌细胞培养操作台中进行后续的微接触印刷步骤，即对M垫进行功能化处理。

现在我们已进入组织培养操作台，可以完成对印章的灭菌处理。具体操作是：将印章从结晶皿中取出，浸入盛满乙醇的培养皿中，以冲洗掉任何残留的杂质，随后再浸入盛有水的培养皿中，以去除残留的乙醇。接着，我们用氮气流吹干印章，直至表面不再有可见的液滴残留。

接下来的步骤是用蛋白质溶液对印章进行上样。我们所使用的蛋白质溶液为每毫升去离子水中含有50微克的纤维蛋白。用移液器吸取适量蛋白质溶液，然后将其滴加到印章表面。

您需要在印章表面的边缘放置少量液滴。首先，对所有将要使用的印章重复此操作，我本应提前完成这一步骤。因此，在将液滴放置于所有印章边缘后，下一步是连接这些液滴，并用蛋白质溶液填充印章表面。

我们这样做的原因是液滴中的蛋白质溶液会扩散到液滴下方，使印章表面变为亲水性，从而更易于铺展细胞外基质蛋白。因此，需对所有正在使用的印章重复此步骤。在将蛋白质溶液涂布到印章表面后，给印章“上墨”的最后一步是确保边缘也被覆盖。为此，只需将移液枪头倾斜，沿印章表面边缘移动，使其同时接触到PDMS印章的边缘和蛋白质溶液即可。

再次重复上述操作，处理所有需要蘸取墨液的印章的各个边缘。现在我们已完成印章的蘸墨过程，将印章放置于组织培养超净台中静置一小时，以促进蛋白质充分吸附到印章表面。经过一小时的等待，使蛋白质完全吸附在印章表面后，现在可以用水冲洗印章，并用氮气吹干。

为此，我们取无菌水并将其倒入含有印迹的培养皿中。注意不要将水直接倾倒于印迹表面，必要时可使用移液器。加入的水量无需精确，只要使水位高于蛋白溶液即可。

此后，用无菌镊子取一个印模，将其浸入新的培养皿中的水中，然后用氮气轻轻吹干。当观察到印模上不再有蛋白质溶液的液滴时，即表明其已干燥。对所有需逐个处理的印模重复此步骤。

现在，我们已经将印章冲洗并晾干，接下来需要通过紫外臭氧处理来活化 mpad 基底。我将培养皿的皿盖从上方取下，然后将培养皿放入紫外臭氧处理仪中。由于聚苯乙烯具有紫外吸收性，我将仪器抽屉关闭，设定时间为七分钟，开始处理。

现在我们回到组织培养超净台，准备对刚刚经过紫外臭氧处理的 mpad 基底进行印迹。操作时，用镊子夹起已清洗并干燥的印模。可以手持印模的侧面，但切勿触碰印模的表面。

调整镊子中的印模，使蛋白质面朝上以便操作。然后将镊子翻转，注意保持蛋白质面朝下，缓慢地将印模与eds接触。1至30次的印模通常较黏，可能需要使用第二把镊子才能将印模从镊子上取下。

可将印章从约两毫米至约八毫米的高度下落至emeds上。然后倾斜emeds培养皿，用镊子轻轻按压，使印章与eds之间形成接触。接触是否形成可通过以下两种方式之一判断。

第一种方法是通过印章的侧面观察ED表面。虽然在相机下可能难以看清，但肉眼可以清晰地通过印章侧面观察到印章与表面接触的情况。第二种确保接触的方法是，将带有盖子的培养皿从组织培养罩中取出，在倒置显微镜下进行观察。

通过显微镜观察干涉图样，您应能够判断印章何时与eds接触，以及是否发生接触。一旦确定接触，印章只需与该eds基底保持接触数秒钟即可。因此，现在可以移除印章。

为此，用一对镊子将 Eds 向下折叠，并以一个流畅的动作将印模剥离。务必记录好已使用印模的 Eds 以及之前已经用过的印模。对每个需要使用的基底，针对每块 EMPA 重复此操作一次。

现在我们已经制备了 EMPA，下一步是对它们进行灭菌，然后将其在一种名为 dye eye 的亲脂性染料中孵育。Dai 是一种带有荧光标记的亲脂性分子，可在一段时间内扩散进入 PDMS，从而让我们能够在显微镜下观察到微柱的形变情况。接下来，我将依次取出每一块独立的 EMPA 基底，依次浸入 100% 乙醇、70% 乙醇、去离子水、去离子水、去离子水、去离子水。

最后，加入浓度为每毫升5微克的DiI溶液。DiI溶液具有荧光性，因此为了尽量减少其暴露于环境光并防止光漂白，在组织培养操作台中孵育一小时期间，我们用铝箔覆盖培养皿。现在，EM垫已在DiI溶液中孵育一小时，我们可以移去铝箔，并用溶液冲洗去除DiI溶液。

我们通过在无菌水中进行三次连续浸洗来冲洗，最后将材料浸入0.2%的F1 27溶液中（即0.2%质量/体积）。在整个浸洗过程中，必须尽量减少EM垫暴露在空气中的时间，以防止ED基底受损，特别是避免两个微柱结构相互塌陷贴合。

0.2%的F127是一种三嵌段共聚物，由亲水性和疏水性区域组成。亲水性区域能够抵抗蛋白质吸附，从而抑制细胞黏附；而疏水性区域则可与疏水性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）结合。因此，当PDMS浸泡在F127溶液中时，F127会结合到PDMS表面并阻止细胞黏附。

在铝箔包裹的培养皿中于慢性 F1 27 中孵育一小时后，我们可通过依次浸入无菌水、无菌水和 PBS 中来洗去 F1 27。在浸入 PBS 并完全洗去产物 F1 27 后，即可将基底材料浸入所选的细胞培养溶液中。我刚刚将 EMPAs 浸入的细胞培养溶液可含有血清和/或其它生长因子和/或添加剂，如青霉素和链霉素。

所有这些成分均与 EMPAs 治疗完全兼容。下一步是在将 eds 浸入细胞培养液后，将选定的细胞接种到 eds 上。在此特定实验设置中，我将把牛肺动脉内皮细胞接种到三个不同的培养皿中。

我使用三个不同培养皿的原因是，其中两个培养皿将用已知的触敏性抑制剂进行处理，以抑制微柱的偏转，这一点我们可在后续实验中进行检测。因此，在接种细胞时，我只需取适量细胞悬液，用移液器吸取适当体积，然后逐滴加入每个培养皿中。加入足够数量的细胞，以确保在检测牵引力时，细胞在基底上以单细胞形式存在。

接种量取决于接种面积以及特定细胞的生长速率。我们通常每平方厘米基质接种1500至5000个细胞。完成细胞接种或细胞悬液处理后，将细胞悬液逐滴加入培养皿中，然后轻轻前后左右交替摇动培养皿数次，以使细胞悬液充分混匀。

对所有使用的基质重复此过程。接种细胞后，立即将其放入37摄氏度的培养箱中，并维持适当浓度的二氧化碳以缓冲pH值和细胞培养基。接种细胞约两小时后，将基质从一皿培养基转移至另一新鲜相同细胞培养基中，对细胞进行洗涤是合适的。

进行此洗涤步骤的原因是，大多数细胞在两小时时已开始铺展，并几乎达到其最终的铺展面积。通过洗涤细胞和基底，可去除细胞培养基中未贴附的悬浮细胞。这样，在牵引力终点检测中，只有已贴附至EDS并开始铺展过程的细胞才会被检测到。

一种可在微图案阵列（MPAs）上培养的细胞中进行的检测是延时成像，用于定量分析细胞收缩力的动力学变化。特别是，细胞收缩力对可溶性因子的响应动力学具有研究意义。已知生物化合物和合成化合物等可溶性因子可能增强、减弱或对细胞收缩力产生未知的影响。

在此活细胞实验中，我们将使用这台倒置落射荧光显微镜。在显微镜载物台上，已连接一个小型培养箱，该培养箱与温度控制器相连，以维持 37 摄氏度及 5% CO2 的环境。我们将使用 60 倍平场复消色差物镜进行高倍成像。

现在我们将准备用于成像的冲击基质。我们用于成像的60倍物镜的工作距离为200微米，远小于之前接种细胞的组织培养皿的厚度。因此，我们无法在组织培养皿中对植入物上的细胞进行成像。

为了解决这一问题，我们使用这些玻璃底培养皿。现在，我将底物倒置转移到玻璃底培养皿中，使细胞和微柱尖端位于玻璃底界面处。因此，当将其置于显微镜下观察时，细胞与物镜之间的工作距离小于200微米。

现在我们已准备好将样品置于显微镜下进行成像。接下来，我将打开活细胞培养箱室，将样品放入其中，并重新盖上培养箱室的盖子。此时，我将扫描基底以寻找一个合适的细胞。

进行成像。最有效的方法是使用10倍的平场物镜，这将使我能够观察到更宽的基底视野，从而更快地找到细胞。我对良好细胞的筛选标准是单个细胞。

它不应接触任何邻近的细胞，并且其大小应与基质上所有其他细胞相比处于平均水平。我已找到一个适合观察的细胞。接下来，我将物镜切换至60倍，以高倍放大观察该细胞。为此，我们需先将物镜离焦，以避免在旋转过程中碰撞载物台。

旋转物镜转盘以打开培养室，部分旋转60倍物镜，60倍物镜为油镜，因此需在物镜前端滴加一滴浸油。现在继续旋转转盘，使60倍物镜到位。随后关闭培养室，并重新调焦物镜，使细胞重新进入焦点。

当我精确调整好细胞的位置和焦距后，我将切换到CCD相机，以便在计算机屏幕上预览细胞，然后开始延时成像。在本实验中，我将以每分钟一次的间隔同时采集相差图像和荧光图像，因此延时成像现已开始，我将让其持续运行10分钟或10帧。此时，10分钟已过去，我将打开培养腔，在培养皿中加入血清，以刺激细胞的收缩活性。

计时器仍在运行，因此我需要迅速完成此操作。接下来，我们将继续对细胞成像30分钟，以追踪收缩力的任何变化。完成延时成像后，可将图像序列合成为视频展示。以下是相差图像和荧光图像的两个视频。

左侧为一个主要透明细胞的相差显微图像，细胞以黑色轮廓标出，分布在20个微柱的顶端，这些微柱为呈矩形晶格排列的圆形结构。右侧为同一细胞的荧光显微图像，但仅可见微柱。

如果我回放这些视频，您将看到细胞附着的微柱最初较弱，轻微偏转，与矩形晶格偏离很小。在视频播放至中期时，我在培养基中添加了血清。血清会刺激细胞，使其收缩力增强。

当细胞对下方微柱施加更大的牵引力时，细胞周边的微柱开始向内弯曲。在荧光录像中，您现在可以看到微柱明显偏离了其在矩形晶格中的原始位置。正如我稍后将描述的，通过分析这些图像中微柱位置的位移，可用于研究该细胞的牵引力。

此前，我们已经了解了如何制备 mpad 基底以及如何对其进行功能化处理以用于细胞培养。现在您会注意到，我已将制备好的 mpad 基底分别放入三个不同的细胞培养皿中。细胞已培养过夜，接下来我将对每个培养皿中的细胞施加一种不同的可溶性试剂，这些试剂以已知的方式调控细胞的收缩性。

固定细胞30分钟后，我们便可以定量测量由此产生的牵引力。在加入可溶性因子后30分钟，再加入收缩力抑制剂，此时需使用多聚甲醛固定细胞，以锁定牵引力的当前状态。在此过程中，重要的是使用含有钙和镁的多聚甲醛，我们采用体积百分比为3.7%的多聚甲醛。将基底浸入多聚甲醛中的方法，抱歉，与在功能化过程中将基底浸入不同RINs时所用的方法相同。

也就是说，在操作过程中必须避免底物干燥，因为这可能导致结构塌陷。在转移底物后，我将底物置于多聚甲醛中孵育20分钟。20分钟结束后，将底物从多聚甲醛中取出。此时细胞已经固定，可以对这些样品进行标准的免疫染色处理。

为此，我们将基底正面朝上放置在帕拉膜上，并用移液器加入足够的 PBS 以完全覆盖基底，使其保持在 PBS 液面以下。随后用 PBS 将基底清洗三次，以去除培养物中可能残留的甲醛。用 PBS 清洗三次后，即可将基底转移至后续的免疫染色步骤。

我们使用镊子夹取基底，在免疫染色的第一步中将其倒置，加入透化试剂。本实验中使用的是含0.2% Triton X的PBS溶液。然而，使用者也可根据自身需求选择最合适的透化试剂。

我们对所有基底重复此操作，这就是我们在免疫染色过程中处理基底的方法。免疫染色完成后，将基底固定在标准的1英寸×3英寸玻璃载玻片上，随后可在任何透射荧光显微镜（无论是倒置还是正置）上进行观察。通过共聚焦显微镜对样品进行成像，我们可以聚焦于微柱底部，以获取未发生偏转的即零位位置图像。

随后，我们可以将焦点向上移动至柱状结构的顶端，再次拍摄柱状结构的图像。通过比较顶部与底部的图像，我们能够测量柱状结构的偏转程度，并计算细胞为产生此类偏转所生成的牵引力。通过对多种不同条件下大量细胞执行此过程，我们便能够比较不同条件下细胞所产生的牵引力。现在，我们已经采集了活细胞和固定细胞的图像，接下来的任务是测量偏转，进而测定细胞内的牵引力。

为此，我们使用 MATLAB 编写了一个计算机程序。以下是本分析中将使用的三幅图像。第一幅图像是细胞的相位图像。

这有助于确定细胞的位置。第二幅图像是微柱顶端的荧光图像。我们利用该图像来定位微柱尖端的位置。

如您所见，其中一些柱状结构发生了偏转，偏离了大多数柱状结构所处的矩形晶格，例如这个柱状结构以及这个柱状结构。我们将使用的第三幅图像是基底图像，它捕捉到了柱状结构在某一焦平面的位置，该焦平面穿过这些柱状结构的底部。

在此阶段，发生偏转和未发生偏转的柱体均应位于其静止位置，即未偏转的位置。在矩形晶格中，可以看到在第二幅图像中其底部发生偏转的柱体，目前处于其 FL 位置。该图像用于确定柱体在其反射位置下的位置。

接下来，我们加载 MATLAB 程序，程序将提示我们加载这三幅图像。为文件命名。您将看到相位图像。

我们将绘制一个方框标出细胞的位置，以便程序知道需要分析哪些微柱。随后，程序会对裁剪后的图像进行强度分析、阈值处理和归一化，以确定微柱的 OID 坐标。左侧是来自顶部图像的微柱归一化后的图像，而右侧是来自底部图像的相同微柱归一化后的图像。

在获取微柱的 OID 坐标后，程序即可计算每根微柱顶端与底端之间的位移矢量。通过将这些微柱位移矢量乘以微柱的弹簧常数，可将其转换为力矢量。我们可以采用多种方式分析这些细胞力，例如每个细胞的平均受力或每根微柱的平均受力。

一个有用的结果是生成一个矢量图，从中我们可以直观地观察力的空间分布情况。这是刚刚完成分析的细胞，可以看到我在微柱上叠加了黄色箭头，这些箭头的方向表示作用力的方向，长度表示作用力的大小。通过对时间序列图像（例如制作延时电影所需的一系列图像）重复执行此图像分析过程，我们可以获得一个时间上的动态序列。

这是用血清刺激过的细胞的录像。如您所见，当加入血清后，细胞的收缩力增强，对微柱的偏转也更加明显。此外，我们还可以对大量处于不同处理条件下并经固定和染色的细胞进行力学量化分析，例如这些箭形图所示：分别用对照化合物和收缩力抑制剂处理的细胞。

如您所见，在对照组中，细胞上的力矢量在长度和大小上均大于使用了收缩性抑制剂的两种情况下的力矢量。我们已经介绍了大量内容，涵盖了从微加工到样品制备、实验操作及数据分析的整个流程，以展示这些基底的多功能性。

我们介绍了两种不同的实验方法：活细胞成像和固定样本检测，并对从这两种实验中获得的细胞进行了分析，展示了速度矢量图和速度矢量动态图。利用这一强大工具，研究者可对细胞收缩性进行多种空间和时间维度的分析。如您所见，该方法融合了多个不同学科的技术，包括微加工技术、基础细胞生物学、表面科学、图像分析与处理，以及其他多个领域。

正是由于该方法基于多种不同的工程技术，因此诸如微柱几何形状、诱导的可溶性因子以及分析微柱偏转的方法等参数，均可根据用户需求进行定制。我们希望，在过去二三十分钟内所概述的这一方法的可视化演示，能够为其他研究者进一步深入探究细胞牵引力的调控机制、功能效应及其产生过程提供一个起点。