构建多重人工细胞微环境阵列

该方法有助于解决干细胞工程领域的一个关键问题，即细胞微环境如何改变细胞的表型和功能。该技术的主要优势在于，它可在一块培养板内为细胞提供多种人工构建的微环境，而这是传统微接触培养板方法无法实现的。演示本实验操作的将是本实验室的技术人员 Koki Yoshimoto 和 Risako Sakai。在根据文本方案设计出用于纳米纤维阵列和微流控结构模具的三维掩膜图像之后。

使用3D打印机打印掩模和模具。为制备用于电纺丝的聚合物溶液，将13%的PMGI液体用四氢呋喃稀释至9%。将0.08克PS溶解于体积比为1:1的四氢呋喃与二甲基甲酰胺混合溶剂中，并加入液体试剂定容至最终体积为1毫升、浓度为8%（重量/体积）的PS溶液。

将0.1克GT溶解于水、乙酸和乙酸乙酯中，并用混合溶剂定容至1毫升，制备成10%（重量/体积）的GT溶液。接下来，使用磁控溅射设备在聚苯乙烯基板上沉积一层5纳米厚的铂层，该基板在电纺丝装置中作为阴极。将每种聚合物溶液装入配备23号不锈钢钝头针头的5毫升注射器中。

然后将注射器固定在注射泵上，使其与静电纺丝装置的收集器相距12厘米。将注射器针头连接至高压电源，并将其设置为11千伏。随后将泵送速率设为20毫升每小时，同时将温度和湿度分别维持在30摄氏度和体积分数低于30%的水平。

现在将掩模放置在基板上。然后通过掩模的孔洞，通过改变电纺丝时间在基板上制备出不同密度的纳米纤维。从基板上取下掩模，并重复进行纳米纤维的制备。

当阵列完成后，将其置于25摄氏度的干燥器中16小时，以蒸发残留溶剂。为交联GT纳米纤维，使用0.2摩尔EDC和0.2摩尔NHS的乙醇溶液处理纤维，并在25摄氏度下孵育样品4小时。

用99.5%的乙醇冲洗GT纳米纤维两次，并在25°C下真空干燥培养板16小时。为制备微流控结构，将2克PDMS固化剂与20克PDMS基底混合，然后将预混的PDMS混合物倒入已制备的模具中。

在干燥器中对预混的PDMS溶液脱气30分钟。然后将预混的PDMS溶液在65°C烘箱中固化16小时。组装Macme阵列时，将固化的PDMS结构从模具上剥离，并用70%乙醇清洗。

然后在PDMS结构的底面释放大气电晕。迅速将PDMS结构与纳米纤维阵列组装在一起。随后将组装体在65°C烘箱中烘烤两天。

使用DPBS洗涤培养在35毫米培养皿上的H9HESCs。然后向培养皿中加入0.5毫升重组胰蛋白酶轻度蛋白酶，并在37°C下孵育1分钟。小心吸除上清液中的蛋白酶混合物。

立即加入HPSC培养基，并轻轻反复将培养基冲向培养皿表面，以解离细胞。然后将解离的细胞转移至15毫升锥形管中。在200 × g条件下离心3分钟。

吸除上清液，并将细胞重悬于预热的HPSC培养基中。然后将12 µL细胞悬液移入每个微流控腔室中。根据文本方案对细胞进行荧光标记后，从Macme阵列上剥离PDMS微流控结构。

然后从Macme阵列中去除残留的PBMS，向染色后的细胞中加入含90%甘油的PBS，并加盖盖玻片。最后将培养板倒置于倒置荧光显微镜的载物台上，并使用显微镜成像软件采集12位彩色图像。

图中显示的是在明胶纳米纤维上以高初始接种密度培养的H9HPSCs的免疫荧光图像，并使用了3种细胞表型标志物进行染色。采用SOM分析将高维多参数数据集转化为低维二维图谱，以比较每组数据集中四种表型标志物表达水平的均一性与异质性，并对SOM节点进行了无监督层次聚类分析。如图所示，所有组别中OCT4的表达均高于在基底膜凝胶基质（MG）上培养的细胞。第一组显示出较强的EdU信号，表明大多数细胞处于活跃增殖状态。

因此，第一组的微环境适合人多能干细胞（HPSC）的维持，因为当细胞周期的间隙期缩短时，未分化的HPSC会快速增殖。第二组包括初始接种密度不足的细胞，以及在二维GT支架上培养但无法支持HPSC自我更新的细胞。例如，该样本的EdU信号消失，且annexin V水平略有升高，表明这些细胞已失去干性，并逐渐进入凋亡状态。

来自第三组的PMGI MidNF HighCD，代表由PMGI纳米纤维基质构成的微环境，其OCT4和EdU信号的变化幅度较其他条件更大。该技术建立后，为干细胞领域的研究人员探索组织工程和高通量筛选开辟了道路。