使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

本实验的总体目标是以高度并行且经济高效的方式，研究机械负荷对单个蛋白质蛋白水解切割的影响。在本演示中，首先检测基质金属蛋白酶-1对胶原蛋白的切割作用：将胶原三螺旋分子固定在流动池的玻璃盖玻片上，随后将微米级磁珠连接至单个胶原分子。第二步是将流动池安装到磁镊装置中，并检查盖玻片表面非特异性结合的磁珠是否已被清除。

接下来，将蛋白酶加入流动池中。最后一步是通过实时监测微珠的脱落来确定蛋白水解速率。通过在不同蛋白酶浓度和作用力条件下测量微珠脱落速率，可以利用极少量的底物和蛋白酶推导出标准的酶动力学参数。

此外，该技术可提供有关机械力对蛋白水解速率以及底物蛋白在切割过程中伴随发生的结构变化的独特信息。与光学镊子轨迹和原子力显微镜等其他方法相比，该技术的主要优势在于通量高且成本效益好。尽管该方法能够揭示机械力对单个蛋白质蛋白水解切割的影响，但其所用仪器和技术也可广泛应用于多种生物物理问题的研究，包括力对蛋白质折叠和构象变化的影响。

开始流动池制备，首先通过超声处理清洁盖玻片。将盖玻片放入一个可容纳它们且能适配超声仪的小型玻璃容器中。向容器中加入异丙醇，并在超声水浴仪中处理20分钟，随后弃去异丙醇，再用大量去离子水冲洗盖玻片。

将容器中加满水，超声处理20分钟。超声处理后，在过滤的无尘气流中干燥盖玻片。检查盖玻片，仅使用无污迹的盖玻片。

将盖玻片在本生灯产生的气体火焰中缓慢移动数秒，轻轻灼烧，以去除残留的灰尘和水分，注意避免因过热导致盖玻片变形。此步骤可清除表面残留污染物。

接下来，使用双面透明胶带将两张盖玻片粘合在一起。首先将胶带剪成约三厘米长、0.3厘米宽，将其粘贴到一块22乘40毫米的盖玻片上，在中间留出1.6厘米的通道。用移液器吸头轻轻按压盖玻片，确保胶带已牢固粘附。

磁镊装置由本实验室使用带有一个直径为1毫米小孔的铝制L型支架构建，并安装在垂直Z轴位移器上，以调节镊子的高度。在小孔两侧的支架上各固定一块永磁性稀土磁铁，以产生磁场梯度。对磁阱进行正确的校准对于本实验步骤至关重要。

为了确保实验成功，我们采用本节所述的两种不同方法。为校准磁阱，需使用按照书面实验方案中所述、在5'端和3'端分别用生物素和地高辛标记的λ噬菌体DNA进行校准。为将DNA连接至流动池，首先用抗地高辛抗体溶液填充流动池，并让抗体在玻璃表面吸附15分钟。

接下来，向流动池中加入牛血清白蛋白（BSA）溶液，以封闭其表面，防止DNA非特异性吸附。需要注意的是，在此封闭步骤及所有后续步骤中，加入流动池的试剂体积应至少为流动池体积的两倍。本演示中流动池体积为75 µL，将流动池在室温下孵育45分钟。

重复此步骤后，加入 50 皮摩尔的功能化λ DNA，并使其在盖玻片上结合 15 分钟，随后用一份 XPBS 洗去多余的 DNA。最后，加入包被链霉亲和素的超顺磁性微珠，使其与固定的 DNA 结合 15 分钟。本实验中使用的是 2.8 微米的微珠。

用一份 XPBS 洗去多余的磁珠。接着，通过将永磁体移至远离样品表面的位置，进行磁镊校准。然后将制备好的流动池放入显微镜中。

将永磁体移至流动池上方的指定位置。通过聚焦远离两个玻璃表面的Lambda DNA功能化微珠来选择成像焦平面。正确的焦平面应使目标微珠呈现明亮的中心。

以高于80赫兹的频率采集500帧微珠运动的视频。将磁铁逐步靠近样品表面，并在每个位置记录微珠运动的视频。当距离大于5毫米时，以1毫米为间隔移动；在1至5毫米范围内，也以1毫米为步进距离进行移动。

对于小于1毫米的距离，以0.5毫米的步长移动；对于每组数据，使用二维高斯拟合追踪微珠的中心位置。根据书面实验步骤中所述，通过布朗运动涨落计算受力。通过功率谱Lian拟合验证受力计算的准确性。

为了确定滚落频率，可在胶原蛋白肽与流动池结合之前，通过文本中提供的信息找到施加力与滚落频率之间的关系，并表达和纯化胶原蛋白肽及MMP-1蛋白。首先将抗Myc抗体溶液加入流动池中，在室温下孵育20分钟，使抗Myc抗体结合到流动池表面。随后使用5毫克/毫升的BSA对流动池进行封闭，以防止蛋白质的非特异性结合。加入150皮摩尔的胶原蛋白肽，使其通过Myc标签与抗体结合，孵育45分钟。

加入2.8微米珠至流动池前，使用PBS缓冲液洗去多余的胶原蛋白。应使用强磁铁将珠子从链霉亲和素分裂及包被珠溶液中分离，然后重悬于PBS中。该过程应重复三次。

此步骤对于使2.8微米珠与表面固定的胶原肽结合至关重要。接下来，加入链霉亲和素包被的超顺磁性珠，并使其与胶原分子结合45分钟。一旦流动池组装完成并含有胶原肽和磁珠，即可在磁阱中对流动池进行成像。

在低作用力下，部分微珠有时结合较弱，以非特异性方式吸附在表面。施加适度的作用力可确保这些微珠被释放。将活化的酶加入流动池中。

在此情况下，将 MMP-1 通过加入 3.5 毫摩尔的 PMA 进行预激活，并在 37°C 下孵育 3 小时。一旦将流动池重新放入磁力镊子装置中，立即记录覆盖几个视野的视频，通常可获得数百个附着的微珠。该测量对应时间为零点。

重复在固定时间点记录多个视野的过程，直至所有微珠脱落或无法再观察到进一步的蛋白水解。磁镊针对1微米和2.8微米的微珠进行了校准。通过分析在强制蛋白水解实验中不同磁铁位置下观察到的布朗波动幅度，并计算滚降频率，可将剩余微珠的归一化数量随时间变化作图，从而确定蛋白水解速率。

该过程可针对不同的酶浓度和作用力进行重复。蛋白水解速率依赖于施加的力。在 1 pN、6.2 pN 和 13 pN 的作用力下测定了蛋白水解速率。

未发生蛋白酶解的微珠比例在超过15分钟时保持稳定，在不同实验中该值均约为0.25。在本研究中，该检测方法使我们能够测量基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的催化效率随施加力的变化情况。通过数据分析，我们发现胶原蛋白三螺旋结构在发生蛋白水解之前必须先发生局部解旋。

一旦掌握，该技术若操作正确，可在五到六小时内完成。需要注意的是，每个视野至少需要30至50个微珠，才能获得具有良好统计学意义的数据。切勿忘记，丙烯酰胺（PMA）可能具有极高危险性，在进行本实验时，应始终采取防护措施，如佩戴手套、实验服和面罩。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用磁镊技术测量外力对单个蛋白质蛋白水解切割的影响。磁镊是研究单分子生物物理实验的有力工具。该技术还可拓展应用于其他蛋白酶与底物的组合研究。

此外，类似的技术也可用于研究蛋白质的结构动态，以及了解其他结合或修饰 RNA 和/或 DNA 的蛋白质。