利用iPSC来源的前体细胞生成血脑屏障芯片

取一个微流控芯片，其上设有相互重叠的、基质包被的通道，并由多孔膜隔开。

在上通道中接种iPSC来源的神经前体细胞。孵育以促进细胞贴壁，随后洗去未贴附的细胞。

接下来，将iPSC来源的脑微血管内皮细胞接种至底部通道中。

倒置芯片并进行孵育，使内皮细胞贴附于底部通道膜的一侧。

接下来，翻转芯片以使细胞附着在通道的下侧，形成单层管状结构。用细胞专用培养基清洗两个通道。

在上通道中持续灌注神经分化培养基，在下通道中持续灌注内皮细胞培养基。

内皮细胞利用培养基中的生长因子成熟并形成类似血管的紧密连接，从而构成血管的血液侧。

神经营养因子促进神经前体细胞分化为多种脑细胞，形成脑侧。这些细胞与内皮细胞相互作用，在芯片上形成血脑屏障。

首先，将装有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。使用P200移液器，向进样口加入200 µL神经分化培养基，并从出样口缓慢吸取液体，轻柔地冲洗两个通道。注意避免接触进样口和出样口，小心吸除芯片表面多余的培养基液滴。

轻轻振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。为了将iPSC来源的神经前体细胞接种到上层通道以形成脑侧，取一支含有30至100微升细胞悬液的P200吸头（细胞浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞），将其插入上层通道入口，然后轻轻从移液器上释放吸头，缓慢加入细胞悬液。

取一个空的P200移液枪，按压活塞，插入顶部通道出口，小心地将单细胞悬液吸入枪头中。将芯片转移至显微镜下，检查顶部通道内细胞分布的接种密度是否均匀。确认细胞密度达到约20%覆盖率后，立即将芯片放入37摄氏度的培养箱中孵育两小时。

随后，向入口加入新鲜的神经分化培养基，以冲洗未贴壁的细胞，并用移液器从出口收集液体。将细胞置于37摄氏度下静置培养，每天更换神经分化培养基。在iNPCs贴壁后或接种后的次日，将含有制备好的芯片的培养皿移至生物安全柜中。用200微升内皮细胞培养基轻轻冲洗底部通道。

避免接触端口，小心地从芯片表面吸去多余的内皮细胞培养基液滴，确保两个通道中均保留培养基。轻轻振荡细胞悬液，以保证细胞悬液均匀。使用P200移液枪吸取30至100微升浓度为14至20 × 10⁶ 个细胞/毫升的iPSC来源的脑微血管内皮细胞悬液，将枪头插入底部通道的入口。

实现功能性屏障特性的最关键步骤是脑微血管内皮细胞的接种。必须以适当的密度接种细胞，以避免气泡形成，并确保细胞在器官鞘内均匀分布。

用带有空吸头的P200移液器按下压杆，插入底部通道出口，然后缓慢释放移液器压杆，将单细胞悬液小心地经由底部通道吸出。吸取芯片表面多余的细胞悬液。避免直接接触进样口和出样口，以确保通道内的细胞悬液不会被吸出。将芯片转移至显微镜下检查接种密度。

底部通道中充满细胞，细胞之间无可见间隙。确认细胞密度正确后，将细胞接种至其余芯片中。为使细胞贴附于底部通道上方的多孔膜上，需将每片芯片倒置，并置于芯片支架中静置。在150毫米培养皿内放置一个含有无菌DPBS的小型储液槽，以为细胞提供湿度环境。

将芯片在37摄氏度下孵育约三小时，或直至底部通道中的细胞贴壁。一旦iPSC来源的脑微血管内皮细胞贴壁，将芯片翻转回直立位置，以促进细胞在底部通道底部区域的贴附。在接种iPSC来源的脑微血管内皮细胞48小时后，将内皮细胞培养基置于37摄氏度水浴中预热一小时，以平衡培养基温度。

然后，将培养基置于真空驱动的过滤系统中孵育15分钟以去除气泡。接着，用70%乙醇对便携式模块包装外表面及托盘进行消毒，擦拭后转移至生物安全柜中。打开包装，将模块放入托盘内，使储液槽朝向托盘后方。用移液器向每个入口储液槽中加入3毫升预平衡的温热培养基。向底部通道的入口储液槽中加入内皮细胞培养基，向顶部通道的入口储液槽中加入神经分化培养基。

然后，将300微升预平衡的温热培养基直接加入每个出口端口上方的出口储液槽中。每个托盘上最多放置6个便携式模块。将托盘送入培养箱，并用托盘手柄朝外的方式完全推入培养模块中。在培养模块上选择并运行灌注循环。关闭培养箱门，使培养模块对便携式模块进行约一分钟的灌注。

当状态栏显示“就绪”时，启动循环完成。从培养模块中取出托盘并移至生物安全柜中。在生物安全柜内检查每个便携式模块的底面，确认便携式模块已成功启动。观察四个端口处是否有微小液滴形成。若任一便携式模块未出现液滴，则需对该模块重新运行启动循环。若培养基滴落在托盘上（更常见于出口端口附近），请使用70%乙醇清洁托盘。

接下来，用温热的、已平衡的细胞特异性培养基轻轻冲洗每个芯片的两个通道，以去除通道中可能存在的气泡，并在每个进样口和出样口的顶部放置少量培养基液滴。将带支架的芯片插入便携式模块中，每块托盘最多可放置六个。将托盘插入培养模块。在培养模块上设定相应的器官芯片培养条件，例如流速和拉伸参数。当Regulate循环完成后（约需两小时），设定的培养条件即开始生效，随后培养模块将在预设的器官芯片培养条件下启动流体循环。