从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

由iPSC生成的脑微血管内皮细胞（BMECs）为研究血脑屏障的功能与功能障碍提供了新的实验模型。我们已采用此方案检测BMECs在扩增和冻存后是否仍保持其屏障特性。该技术能够从患有与血脑屏障破坏相关的疾病的患者中生成疾病特异性的BMECs，从而有助于阐明这些疾病病理生理机制中的关键环节。

为了诱导人iPSC分化为BMEC，先用DPBS洗涤汇合的iPSC培养物一次，然后将细胞与适量的含EDTA酶溶液在37摄氏度下孵育约五分钟。当获得单细胞悬液后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量添加了10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基中进行计数。将细胞稀释至1.56 × 10⁴ 个细胞/立方厘米的浓度，并将2毫升细胞接种至6孔平底板的各个孔中。

在细胞培养箱中培养24小时后，将每孔中的上清液更换为E6培养基，并将培养板放回培养箱中继续培养四天。为了纯化诱导多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞（BMECs），用新鲜配制的IV型胶原蛋白和纤连蛋白溶液按每孔适当体积包被传代培养板，于37摄氏度孵育至少两小时。在分化第六天，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量新鲜的人源内皮细胞无血清培养基中，该培养基需添加B27、碱性成纤维细胞生长因子和视黄酸。

进行TEER分析时，将已分化的细胞接种至经胶原蛋白和纤连蛋白包被的12孔Transwell小室培养板的每个孔中。进行外排转运体活性分析时，将细胞接种至经胶原蛋白和纤连蛋白包被的24孔平底培养板的每个孔中。传代培养24小时后，将每孔中的上清液更换为仅添加B27补充剂的新鲜人内皮细胞无血清培养基。

为了使用TEER测量BMECs的血脑屏障特性，需提前一晚对TEER仪器进行充电，并在将其放入生物安全柜前，用70%乙醇轻轻擦拭仪器和筷子状电极。打开电源，根据制造商的说明校准欧姆表。插入电极后，先用70%乙醇冲洗一次，再用DPBS冲洗一次。

将电极的短端插入嵌入式装置的非典型腔室中，长端插入空白孔的基底外侧腔室。测量完阴性对照反应后，按演示方法迅速冲洗电极，随后测量第一个实验孔。所有测量记录完成后，再次冲洗筷子状电极，轻轻擦拭电极表面，并将其置于安全通风橱中自然晾干。

为了评估细胞的外排转运蛋白活性，在培养的第8天，用10 µM的外排转运蛋白抑制剂溶液处理适量的孔板，并在37°C孵育箱中孵育1小时。孵育结束后，在孵育箱中用10 µM的外排转运蛋白底物溶液处理细胞，持续1小时。孵育结束后，每孔用500 µL DPBS洗涤两次，然后用500 µL含5% Triton-X的DPBS裂解细胞。

五分钟后，使用微孔板读数仪在485纳米激发波长和530纳米发射波长下测定裂解细胞的荧光。对于未用于转运体实验的孔，先用DPBS洗涤细胞两次，然后用4%多聚甲醛固定，以进行细胞核定量。在E6培养基中培养一天后，细胞形态与iPSCs相似。

到第四天，细胞在形态上已明显区别于诱导多能干细胞（iPSCs），并覆盖了大部分孔壁。在人内皮细胞无血清培养基中培养两天后，细胞呈现伸长状和鹅卵石样形态。到第八天，单个细胞形成以大片鹅卵石样排列为主的结构。

可以通过出芽实验来验证由iPSC衍生的BMEC的血管生成潜能。经过三天的生长因子处理后，会形成管状结构。采用本方案生成的iPSC衍生BMEC共同表达了脑、肺、肝和肾中内皮细胞所表达的紧密连接蛋白，以及血脑屏障处表达的血管内皮标志物。

如观察所示，在传代和更换培养基48小时后，由iPSC分化而来的BMECs的TEER值达到与和大鼠原代星形胶质细胞共培养的iPSC来源BMECs所描述范围相当的水平。在此阶段也观察到外排转运蛋白的活性。经过冻存后，TEER测量值较新鲜制备的BMECs为低。

Western blot 分析显示紧密连接标志物（如 occludin）水平降低，而免疫细胞化学结果显示紧密连接蛋白呈现斑点状或松散状分布模式。诱导多能干细胞（iPSC）密度过高或过低均会影响分化效率，并影响血脑屏障特性的正常发育。该方法可利用个体化的脑微血管内皮细胞（BMECs）来研究屏障特性、细胞信号传导及转运体活性，从而模拟血脑屏障功能的生理与病理生理状态。