人干细胞来源神经元在预组装塑料微流控芯片内的区室化培养

分区化微流控装置可实现对高度极化形态神经元的研究。这些装置在基础神经科学研究和转化神经科学研究中均具有重要作用。本方案描述了如何使用环烯烃共聚物芯片对人干细胞分化的神经元进行分区培养。

与PDMS多区室装置相比，这些COC芯片可产生更健康的分化神经元培养物。在本方案中，我们展示了由美国国立卫生研究院（NIH）批准的H9干细胞系分化而来的神经元培养。类似的方法也可用于从mIPSCs分化神经元。

多室芯片必须置于具有额外加湿功能的二级容器中。多室芯片的通道必须先用包被液填充，然后用PBS冲洗。首先，将聚-L-鸟氨酸溶于细胞培养级蒸馏水中，每片芯片配制600微升溶液。

用移液枪吸尽孔中剩余的 PBS，注意移液枪头应远离通道开口。在右上孔中加入 150 微升多聚-L-鸟氨酸工作液。等待 90 秒后，向右下孔中加入 150 微升该溶液。

等待五分钟，然后用左侧孔的溶液重复加样过程。接着，将带有芯片的加湿托盘置于4°C过夜。如果使用培养皿，则用Parafilm封口膜包裹后置于4°C过夜。

接下来，从孔中吸出溶液，确保移液器吸头远离通道开口。重复向左右两孔中各加入 150 µL 无菌水，共两次。制备层粘连蛋白工作液。

在右侧和左侧的孔中分别加入 150 微升的层粘连蛋白工作液。将芯片置于培养皿中，在 37 摄氏度下孵育 2 小时。用不含钙和镁的 PBS 缓冲液冲洗芯片。

在右侧和左侧的孔中各加入 150 微升 PBS。等待五分钟。吸去孔中的 PBS，并用 NSC 培养基冲洗芯片。

在右侧和左侧加样孔中分别加入 150 微升 NSC 培养基。将芯片置于培养皿中，在 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育过夜，以预处理芯片。将人神经干细胞接种到多区室芯片中时，首先使用血细胞计数板测定细胞浓度。

然后，吸出孔中的培养基。用移液器将5 µL细胞悬液加入右上孔，再将5 µL加入右下孔。使用显微镜检查细胞是否已进入通道。

等待细胞贴附至芯片底部，约5分钟。向左右两侧孔中各加入约150微升NSC培养基。将芯片置于合适的加湿容器中，在5% CO2、37摄氏度条件下孵育。

48 小时后，吸出孔板中的神经干细胞培养基，向每个上孔和下孔中加入 150 微升神经分化培养基以进行替换。将神经元置于加湿托盘内的 5%CO2、37 摄氏度培养箱中进行培养。移除轴突区室中剩余的神经分化培养基，并将其放入离心管中。

在 37 摄氏度下保存。将 50 微升病毒溶液与 150 微升预热的培养基混合。向轴突室的两个孔中各加入 100 微升混合液。

在37摄氏度培养箱中孵育两小时。移除并弃去含病毒的培养基。轻柔地将75微升新鲜培养基用移液器加入一个轴突室孔中，使培养基流经通道进入另一个轴突室孔。

重复此步骤一次。最后，用保存的培养基填充轴突室，并将芯片转移至培养箱中。在芯片中使用分化培养基培养一周后，人神经干细胞分化为神经元，并在胞体室中均匀贴壁分布。

相比之下，PDMS装置中的神经元在加入分化培养基后第5天即出现聚集现象，导致细胞健康状况受损。通过mCherry荧光蛋白标记可视化神经元及树突棘，显示芯片内由NSC分化的神经元可形成成熟的突触。神经元被标记了兴奋性突触标志物vGlut1。

免疫染色结果显示，病毒标记的神经元可与兴奋性突触小泡蛋白vGlut1以及神经元特异性标志物Beta-tubulin III共定位。经病毒转导的mCherry标记神经元可将其投射延伸至预组装芯片内形成的轴突区域微环境。对轴突切断前后mCherry标记神经元的图像进行比较，显示轴突被完全切断。

除进行轴突切断操作外，必须确保通道始终保持充满液体。COC-隔室化芯片使用简便，可为神经元损伤、突触形成、突触可塑性以及疾病病理生理学等众多相关研究打开新的窗口。