通过同步光学刺激与视频记录评估功能性神经肌肉接头

从一个生物反应器开始，该反应器具有一个肌肉腔室，腔室内含有嵌入胶原中的肌肉组织，并由腔室的支柱支撑。

神经球通道包含位于胶原基质中的神经球。该神经球的运动神经元表达光敏感通道。

加入含有神经生长因子的分化培养基，以刺激神经元延伸其突起。

定期更换培养基，以确保神经元持续向肌肉组织延伸并形成神经肌肉接头。

使用配备相机和蓝光源的显微镜观察生物反应器。

施加蓝光脉冲以打开神经元中对光敏感的通道，使培养基中的离子流入，从而刺激神经元产生电信号。

这些信号传递 通过 神经末梢投射至神经肌肉接头，将电信号传递给肌肉组织。

同时录制视频。肌纤维出现逐渐收缩，表明功能性神经肌肉接头已形成。

制备4:1比例的胶原蛋白I（3毫克/毫升）与溶解的基底膜基质的混合液。然后，将成肌细胞重悬于该新鲜配制的胶原蛋白混合液中。

接下来，将15微升该细胞-胶原悬浮液加入生物反应器的每个肌肉室中，注意使用移液枪头将悬浮液均匀分布在两个支柱上。在37摄氏度下孵育30分钟，使细胞凝胶混合物聚合。随后，向每个生物反应器孔中加入450微升肌细胞生长培养基。

在运动神经元分化的第11天，将细胞及培养基转移至50毫升离心管中，静置5分钟，使神经球沉降至管底。吸除上清液，将细胞重悬于15毫升运动神经元悬浮培养基中，该培养基需添加20纳克/毫升脑源性神经营养因子和10纳克/毫升胶质细胞源性神经营养因子。

在分化方案的第14天，将运动神经元接种至平台中。配制胶原I（2毫克/毫升）与溶解的基底膜基质按4:1比例混合的凝胶。使用400纳米细胞筛网筛选较大的神经球，并将其重悬于已配制的凝胶混合物中。

小心地从储液池和神经球孔中吸除培养基。然后，向神经球通道中加入15微升凝胶混合物。用10微升移液器吸取10微升凝胶，并挑取一个神经球。将神经球放入神经球通道中，确保其位于腔室内。随后，在神经球放置到位后，一边缓慢抬起移液器，一边释放剩余的凝胶。

在37摄氏度下使凝胶聚合30分钟。随后，向储液槽中加入450微升NbActiv4培养基，该培养基需添加20纳克/毫升的脑源性神经营养因子和10纳克/毫升的胶质细胞源性神经营养因子。

成像时，使用配备科学级互补金属氧化物半导体相机软件的倒置荧光显微镜。将像素合并（binning）设置为2×2，曝光时间为20毫秒，开启卷帘快门，读出速率为540兆赫兹，动态范围设为12位，增益为1，传感器模式设为重叠模式。使用显微镜的2倍物镜对微组织进行成像，并在显微镜载物台上安装活细胞培养舱。

选择包含受神经支配的骨骼组织的目标区域，以减小文件大小并缩短处理时间。然后，在样品与成像物镜之间放置一个594纳米长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。接着，将含有四个生物反应器的矩形四孔板放入活细胞培养腔室中。随后，点击实时 成像，并对准并聚焦于所需的目标区域图像。

从 GitHub 文件夹下载自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino 板和视频采集。然后，将输出视频设置为 day_tissuegroup_tissuename_experiment.ND2 格式。在载物台上设置所需的 x 和 y 坐标后运行宏代码，并以每秒 50 帧的速度采集包含 1,700 帧的快速时间序列图像。

成像后，更换培养基并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔 24 小时，以避免组织疲劳。