构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

本方案描述了如何构建可用于研究神经肌肉疾病及测试潜在治疗方法的功能性三维体外人源神经肌肉接头。该技术结合了同步光遗传学刺激与视频处理方法，可量化神经肌肉接头功能在发育过程中以及受外界因素（如神经毒素和重症肌无力患者血清）影响时的变化。

将肌细胞和运动神经元接种到生物反应器中的步骤起初可能具有挑战性。将胶原凝胶混合物保持在冰上，有助于延长凝胶固化前接种所有细胞的可用时间。首先，按10:1的比例将聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基础剂与固化剂混合，并将混合物放入真空腔中。

关闭所有阀门，开启真空泵，对混合物抽真空至少30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔内继续抽真空1小时，然后以正确方向盖上模具的上半部分并闭合模具。在模具中心位置放置一根六角钢棒，并在两侧用夹具夹紧。

接下来，用PDMS重新填满上层，并在65摄氏度的烘箱中固化模具至少4小时。待模具冷却至室温后，将平台从模具中取出。同时，将玻璃盖玻片浸入1%非离子型表面活性剂聚醇溶液中30分钟，确保盖玻片不重叠且均被充分包被，随后用蒸馏水充分冲洗，并在65摄氏度下干燥过夜。

使用等离子清洗机，在氧气流量为每分钟6升的高功率条件下处理玻璃盖玻片和PDMS平台1至2分钟。处理完成后，将PDMS压在盖玻片上至少30秒，使两者紧密结合。配制体积比为4:1的混合液，其中包含浓度为3毫克/毫升的I型胶原蛋白和溶解的基底膜基质，然后将成肌细胞重悬于该新鲜配制的胶原混合液中。

接下来，将15微升该细胞-胶原悬浮液加入生物反应器的每个肌肉室中，确保使用移液枪头将悬浮液均匀分布在两个支柱上。在37摄氏度下使细胞凝胶混合物聚合30分钟，然后向每个生物反应器孔中加入450微升肌管生长培养基。在运动神经元分化第11天，将细胞和培养基转移至50毫升离心管中，静置5分钟使神经球沉降至管底。

吸去上清液，将细胞重悬于15毫升运动神经元悬浮培养基中，该培养基需添加20纳克/毫升脑源性神经营养因子和10纳克/毫升胶质细胞源性神经营养因子。在分化方案的第14天，将运动神经元接种至培养平台中。配制4:1比例的凝胶混合液，包含2毫克/毫升的胶原蛋白1和溶解的基底膜基质。

使用400纳米细胞筛选择较大的神经球，并将其重悬于已准备好的凝胶混合物中。小心吸去储液池和神经球孔中的培养基，然后向神经球通道中加入15微升凝胶混合物。用10微升移液器吸取10微升凝胶，挑取一个神经球。

将神经球植入神经球通道中，确保其位于腔室内，然后在释放剩余凝胶的同时缓慢提起移液器。在37摄氏度下使凝胶聚合30分钟，随后向储液池中加入450微升添加了20纳克/毫升脑源性神经营养因子和10纳克/毫升胶质细胞源性神经营养因子的NbActiv4培养基。成像时，使用配备科学级互补金属氧化物半导体相机软件的倒置荧光显微镜。

将二分之一设为2×2，曝光设为20毫秒，开启滚动快门，读出速率设为540兆赫兹，动态范围设为12位，增益1，传感器模式设为重叠。在显微镜上使用2倍物镜对微组织进行成像，并将活细胞培养室连接至显微镜载物台。选择包含神经支配的骨骼组织的感兴趣区域，以减小文件大小和处理时间，然后在样品与成像物镜之间放置一个594纳米长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。

接下来，将一个包含四个生物反应器的矩形4孔板放入活细胞培养室中，然后点击实时成像，对所需的目标区域（ROI）进行居中和聚焦。从GitHub文件夹下载自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino控制板和视频采集，并将输出视频文件命名为“day_组织组_组织名称_实验.ND2”。设置载物台上所需的X和Y坐标，运行宏代码，并以每秒50帧的速度采集共1700帧的快速延时图像。

成像后，更换培养基并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔 24 小时，以避免组织疲劳。对于视频处理，从 GitHub 文件夹下载文件，并使用自定义的 MATLAB 代码对视频进行批量分析。

打开递归OS分析脚本，将所有采集的视频放在同一文件夹中。调整预分析参数，然后运行recursiveOSAnalysis脚本，通过并行处理来分析视频。根据需要调整后续分析参数，如基线时间、峰值阈值、最小-最小显著性及最小-最小宽度。

最后，通过运行 recursiveOSMovie 生成视频和图形输出，为每种组织生成相应的视频文件及其收缩性轨迹。本方案已使用两种不同规模的系统进行测试：一种是微流控装置，可生成长约 1 毫米、包含约 20,000 个成肌细胞的骨骼肌组织；另一种是开放式培养皿生物反应器系统，可生成长约 4 毫米、包含约 450 个成肌细胞的肌肉组织。搭建了光学系统，以实现用蓝光对运动神经元进行可控刺激，并结合定制的显微镜宏脚本与定制的 Arduino 代码来提升神经肌肉接头（NMJ）功能。

该代码包含可调节的参数，并根据光脉冲与收缩峰起始之间的时间来判断是否触发收缩。该系统捕捉到神经肌肉接头（NMJ）功能的改善：在组织构建一周后，触发性反应增加，随后功能稳定维持一周。α-银环蛇毒素（alpha-bungarotoxin）完全阻断了所有触发性和自发性收缩，导致NMJ功能彻底中断，表明组织的光刺激依赖于功能完整的NMJ。

用20%重症肌无力患者血清处理48小时后的组织分析显示，其功能较使用健康供体血清处理的对照组组织有所下降。去除并洗去血清48小时后，构建的神经肌肉接头显示出功能恢复。确保所有生物反应器在烘箱中放置时间相同，以避免不同批次之间出现刚度差异。

此外，务必使用显微镜验证运动神经元的接种情况。在此步骤之后，可进行代谢组学、蛋白质组学和CRISPR筛选，以获取更多信息，并更深入地理解病变血清所引起的机制性变化。