使用放射性标记多巴胺测量小鼠脑突触体中的多巴胺摄取

从小鼠脑组织中分离突触体，即来源于神经元突触完整突触前终末的膜结合结构，其中含有多巴胺转运体（DAT）。

将含有配体的缓冲液加入测试管中，将含有配体和DAT抑制剂的缓冲液加入对照管中。

加入突触体。

这些配体可抑制多巴胺降解酶及其他转运蛋白，从而防止多巴胺降解和非特异性摄取。

引入未标记的和放射性标记的多巴胺。

在测试条件下，突触体多巴胺转运体摄取多巴胺。

在对照条件下，抑制剂阻断 DAT 介导的多巴胺摄取，仅允许背景水平的摄取。

将样品加入可截留突触体的微纤维滤膜中。

洗涤以去除未结合的多巴胺。

将滤膜转移至闪烁瓶中。

加入含有放射敏感化合物的闪烁液。

将试管放入闪烁计数器中。

多巴胺的放射性发射使化合物受激发而发光，该光信号由计数器测量。

通过从测试数据中减去参考值来测定突触体多巴胺摄取量。

在此步骤中，向12个指定的1.5毫升微量离心管中加入440微升摄取缓冲液、配体和可卡因，并向其余36个1.5毫升微量离心管中加入440微升摄取缓冲液和配体。将6个2毫升微量离心管标记为10、5、2.5、1.25、0.62和0.31。然后向编号最小的5个微量离心管中各加入750微升摄取缓冲液和配体。

接下来，向标记为10的试管中加入1,455.4 µL摄取缓冲液和配体、14.6 µL未标记的多巴胺以及30 µL氚标记的多巴胺。然后，从标记为10的试管中转移750 µL混合液至标记为5的试管中。充分混匀后，从此试管中转移750 µL混合液至标记为2.5的试管中。用剩余的试管重复此稀释步骤。

随后，将玻璃微纤维滤膜置于12孔滤杯上，用4毫升摄取缓冲液预冲洗。接着，向最初24个含有440微升缓冲液的1.5毫升微量离心管中分别加入10微升突触体膜悬液。轻轻涡旋混匀，并短暂离心，以确保突触体完全浸入缓冲液中。

然后，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。10 分钟后，向前三列分别加入 50 微升浓度为 10 微摩尔和 5 微摩尔的多巴胺，并在 37 摄氏度下振荡孵育 5 分钟。5 分钟后，加入 1 毫升预冷的摄取缓冲液以终止反应。接着用 2.5 微摩尔和 1.25 微摩尔的多巴胺重复上述操作，然后再用 0.62 微摩尔和 0.31 微摩尔的多巴胺重复一次。

将样品加入预先冲洗过的微纤维滤膜中，并用5次、每次4毫升的冰上预冷摄取缓冲液进行洗涤。在前12个样品加入滤膜后，将滤膜转移至闪烁管中。对接下来的12个样品重复此步骤。准备3个最大计数管：将微纤维滤膜放入第49至51号闪烁管底部，并在滤膜上加入25微升浓度为10微摩尔的最高多巴胺溶液。

随后，将全部51个闪烁管置于通风橱中静置1小时。然后，向每个闪烁管中加入3毫升闪烁液，并在摇床中剧烈振荡1小时。为测定氚标记的多巴胺，打开β计数仪程序，选择合适的参数，计数1分钟。对于蛋白质定量，采用标准BCA蛋白检测试剂盒测定突触体的蛋白浓度，以便进行校正，并实现样品间摄取量的正确比较。