同时进行电压钳制与安培法的单细胞多巴胺释放测量

本实验的目的是通过同时采用膜片钳技术和荧光测温法，在电压钳制的神经元中测量多巴胺转运蛋白（DAT）介导的多巴胺逆向转运。首先需利用多巴胺检测荧光测温电极的完整性，随后将荧光测温电极置于细胞附近，并使用膜片钳电极对神经元实现全细胞记录模式。

接下来，使用膜片钳电极控制细胞的电压，同时利用热电极记录由细胞释放的、经多巴胺转运体（DAT）介导的多巴胺信号。最后一步是加入DAT阻断剂，再次记录全细胞电流和热电极电流，从而通过差减法获得特异性由多巴胺转运体介导的电流。该技术的重要意义在于能够在实时控制多巴胺能神经元电压的同时，检测通过多巴胺转运体介导的多巴胺逆向转运过程。

同时进行膜片钳和测压记录的系统需要配备优质微分干涉差（DIC）光学系统和长工作距离物镜的倒置显微镜，以产生系统的直流光源。为降低电噪声，将显微镜的照明装置连接至汽车蓄电池。使用液压显微操作器是因为在本系统的配置中，它们对噪声水平的影响可忽略不计。

使用右手操作器进行电压钳和全细胞记录，左手操作器用于测温。为准备全细胞记录电极，需使用P 2000拉制仪拉制石英移液管。通常，我们使用电阻为3至4兆欧姆的移液管。

接下来，用含有1毫摩尔多巴胺的移液管溶液填充电极。然后将其安装到右侧操纵器的移液管固定器上。确保将盛有多巴胺移液管溶液的容器用铝箔包裹，并在不使用时置于冰上保存。

由于多巴胺具有可氧化性，将溶液置于冰上并避光保存可降低其氧化速率。将银丝穿入电极 holder 中，然后将安培参数适配器旋入电极 holder。接着，向三电极体系中加入足量汞，使其与银丝接触。

将电极安装到适配器时，务必在显微镜下检查 pro CFE 低噪声碳纤维和参数电极，确保尖端清洁且完好无损。操作时应握住碳纤维的远端，以保护碳纤维尖端免受损伤。然后安装 pro CFE Tric 电极。

随后将组装好的电极安装到左侧液压操纵器上，以检测三电极体系的完整性。将其浸入盛有外部溶液的玻璃底培养皿中。在无多巴胺的条件下记录基线电流。

然后向培养皿中加入 10 µL 的 1 毫摩尔多巴胺溶液。一个性能良好的安培电极应记录到氧化电流的增加。务必在实验前后检查安培电极的完整性。

在此步骤中，从培养箱中取出置于玻璃底培养皿中的多巴胺能神经元或经基因工程改造表达多巴胺转运体的细胞。用预热的外部溶液轻轻洗涤细胞或多巴胺能神经元三次。为观察细胞并进行实验，将玻璃底培养皿安装到显微镜载物台上，并调节至合适的焦平面，以清晰观察细胞。

接着，向膜片电极施加正压。使用1毫升注射器，轻轻将两个电极通过显微操作器下降至溶液中，并靠近细胞。然后将参比电极置于细胞左侧，膜片电极置于细胞右侧。

当膜片电极接触细胞时，通过嘴或注射器施加轻微负压，以在细胞上形成吉欧封接。随后，通过负压破裂封接，实现全细胞记录模式，并等待五到八分钟，使含多巴胺的内液充分透析进入细胞内。

然后通过移液管从负40毫伏的钳制电位开始，将细胞膜电压在负60至正100毫伏之间进行阶跃，记录多巴胺转运体（DAT）介导的电流。为确定特异性的DAT介导的多巴胺转运，需在无和有DAT拮抗剂存在的情况下分别记录电化学计量电流。特异性的DAT介导的净电流通过将含有DAT拮抗剂时记录的电流轨迹从无拮抗剂时记录的电化学计量轨迹中减去而获得。

三相电流中的向上偏转对应于此处所示的多巴胺外向流。通过在细胞膜电压从保持电位负40毫伏逐步改变20毫伏（范围从负60毫伏至正100毫伏）的条件下记录由DAT介导的电流，记录时微电极内含2毫摩尔多巴胺，采用全细胞膜片钳模式。此处为与全细胞电流同时获取的电化学电流。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在电压钳制的神经元中测量多巴胺通过多巴胺转运体的逆向转运。请务必在实验前后检查参数电极的完整性，并切记将无拮抗剂时记录的轨迹减去在拮抗剂存在下记录的轨迹。