视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

本实验的总体目标是建立一种新方法，用于对视网膜带状突触中的膜蛋白进行定量分析。该方法有助于解答视网膜神经生物学领域中的关键问题，例如突触在神经环路中蛋白质的精确定位。该技术的主要优势在于能够估算视网膜带状突触处多种蛋白质的数量、密度及其动态速率。

本视频展示了冷冻置换和超薄切片技术的操作过程，由NIDCD高级影像中心的Ron Petralia和Ya-Xian Wang提供技术支持。开始该操作时，需在显微镜下解剖眼球。为此，首先去除角膜。

然后用镊子从视网膜间表面移除晶状体和玻璃体。随后剥离巩膜，直至视网膜与眼球壁完全分离。立即用刀片将视网膜切成厚度为100至200微米的条状片段。

随后，将视网膜条置于含有4%多聚甲醛的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中混合。然后，在室温下将其转移至含4%多聚甲醛和0.01%戊二醛的溶液中。在磷酸盐缓冲液中经数次洗涤后，加入0.15毫摩尔氯化钙，并用甘油溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中对视网膜条进行冷冻保护，以进行后续的冷冻置换。在将冷冻组织置入平底包埋模具前，从透明塑料片上剪下一个薄圆片，放置于每个模具底部，以便在聚合完成后更易于取出包埋块。

现在，在AFS中设置自动程序。向AFS中加入液氮，并将平底包埋模具放入AFS中。向模具中加入含1.5%醋酸铀酰的甲醇溶液，并进行预冷却。

将视网膜条在−184 °C的液态丙烷中进行快速冷冻时，使用细小的刷子将样品放置在固定于浸入杆末端金属 stub 上的双面胶带小片上。随后，用刷子吸去多余的缓冲液。将浸入杆浸入液态丙烷中约五秒钟。

然后，使用充满液氮的小型转运罐将样品转移至 AFS。将冷冻样品以及镊子和手术刀等器械放入 AFS 后，需在腔室内冷却数分钟，再接触组织。或者，也可将器械尖端放入装有液氮的小型转运罐中数秒钟，以实现冷却。

随后，使用精细的解剖刀将样品和胶带从载片上移除。接下来，将两片冷冻切片放入扁平包埋铝制 holder 的七个孔中，每个孔内含有甲醇中的 1.5% 醋酸铀酰。在 AFS 中于 90 摄氏度下保持至少 32 小时。

然后，在自动程序中逐步将温度升至45摄氏度。之后，用预冷的甲醇洗涤样品三次。接着，使用低温包埋树脂作为包埋介质，逐步渗透样品。

第二天，更换树脂，并调整树脂液面至孔的上边缘。在AFS上设置紫外光源，使用AFS中的紫外光照射样品，直至自动程序结束。随后，将样品从AFS中取出。

通常，样品块仍会呈现一些粉红色和颜色。将样品置于室温下的化学通风橱内荧光灯附近过夜，或直至其完全透明。在此步骤中，使用超薄切片机切出70纳米厚的超薄切片，并将其收集到镀有聚乙烯醇-碳的镍网上。

用蒸馏水洗涤载网一次，随后用 TBS 洗涤三次。然后将载网置于 20 微升含 5% BSA 的 TBS 溶液中，室温孵育 30 分钟，接着置于 20 微升含有 goat anti-CTB 及一种 NMDAR 亚基抗体的混合液中，室温孵育过夜。之后，每次用 20 微升 pH 7.6 的 TBS 洗涤载网，共洗涤三次。

随后，用 pH 8.2 的 TBS 洗涤载网一次，每次五分钟。将载网与 20 微升混合液在室温下孵育两小时，该混合液包含与 10 纳米金颗粒偶联的驴抗兔 IgG 和与 18 纳米金颗粒偶联的驴抗山羊 IgG。孵育两小时后，用 20 微升 pH 7.6 的 TBS 洗涤载网三次，接着用超纯水洗涤一次，然后将载网晾干。

随后，在蒸馏水中用5%醋酸铀染色8分钟，再在避光条件下用蒸馏水中0.3%柠檬酸铅染色5分钟。对于三重标记实验，在室温下将载网与20微升混合抗体溶液孵育过夜，该溶液包含抗山羊CTB、抗小鼠PSD-95和抗兔UN2A抗体。然后，将载网与20微升混合IgG溶液孵育2小时，该溶液包含分别偶联18、10和5纳米金颗粒的IgG。

在本步骤中，首先设定比例尺。然后使用 ImageJ 软件测量单个视网膜神经节细胞（RGC）树突的突触后密度（PSD）长度。接着，根据细胞膜平均厚度为 7 至 9 纳米，统计距离膜 10 纳米范围内的金颗粒数量。

将粒子密度计算为每线性微米的金颗粒数量。然后，测量每个金颗粒中心与突触后致密区（PSD）中心之间的距离，以确定突触内位置；或测量金颗粒中心与PSD边缘之间的距离，以确定突触外位置。该图像显示了GluA2/3和CTB的双重免疫金标记。

这是突触前致密体，小金颗粒聚集在RGC突起的突触后密度区（PSD）中。该图像显示了GluN2B和CTB的双重免疫胶体金标记，小金颗粒位于突触外的质膜上。

此图像显示了GluN2A和CTB的双重免疫胶体金标记。与GluA2/3类似，小颗粒聚集在突触后致密区（PSD）内。此处展示了GluN2A、PSD-95和CTB的三重免疫胶体金标记。

在单个 CTB 阳性 RGC 树突的突触后致密区（PSD）内，GluN2A 金颗粒与 PSD-95 金颗粒共定位于同一区域。在进行该操作时，需特别注意应非常轻柔地固定组织，因为某些蛋白质抗原性（如 NMDA 受体）在强烈且长时间的固定条件下会显著降低。观看本视频后，您应能够充分理解如何在视网膜带状突触处高精度地检测和分析膜蛋白。