小鼠海马神经元中突触囊泡内吞的透射电子显微镜成像

首先用含有辣根过氧化物酶（HRP）的高钾缓冲液处理小鼠海马神经元。

高钾使突触前神经元去极化，触发突触小泡的胞吐作用。随后，神经元通过内吞作用回收突触小泡膜，并将辣根过氧化物酶（HRP）摄入新形成的囊泡中。用戊二醛固定神经元，随后洗涤以去除过量的戊二醛。

加入过氧化氢和一种生色底物，该底物被辣根过氧化物酶（HRP）氧化形成电子致密沉淀。洗涤以去除未反应的底物。

用四氧化锇处理以增强膜的对比度，然后洗去多余的试剂。接着加入醋酸铀酰以增强细胞器的对比度。

使用浓度递增的乙醇对神经元进行脱水，并将其包埋在树脂中。

在显微镜下识别细胞密集区域并将其切除，然后制备超薄切片。

将切片转移至铜网上，并用对比染色剂进行复染。

利用透射电子显微镜观察，含有HRP的囊泡呈现为电子致密结构。

在室温下，向每孔加入1.5毫升高钾刺激溶液，刺激海马神经元培养物90秒。在此步骤中，配制pH 7.4的0.1摩尔焦钒酸钠缓冲液。用含4%戊二醛的0.1摩尔焦钒酸钠缓冲液在室温下固定细胞，至少固定1小时。

然后，每次用 0.1 摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞，共洗涤三次，每次七分钟。接着，制备 DAB 溶液，并用 0.22 微米滤器过滤。随后，在 37 摄氏度下将 1.5 毫升 DAB 溶液加入细胞中，作用 30 分钟。

然后，每次用七分钟时间，用 0.1 摩尔的卡可多巴酸钠缓冲液洗涤细胞三次。作为后固定，将神经元在 1.5 毫升含 1% 四氧化锇的 0.1 摩尔卡可多巴酸钠缓冲液中，于 4 摄氏度孵育一小时。

随后，每次用1.5毫升0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤神经元，共洗涤三次，每次七分钟。接着，使用乙酸钠和冰醋酸配制0.1摩尔的乙酸钠缓冲液。再用1.5毫升0.1摩尔的乙酸盐缓冲液洗涤细胞三次，每次七分钟。

随后，在4摄氏度条件下，将细胞与1.5毫升含1%醋酸铀的0.1摩尔醋酸盐缓冲液孵育1小时。然后，用1.5毫升0.1摩尔醋酸盐缓冲液洗涤细胞三次，每次7分钟。在通风橱内，依次用50%、70%和90%乙醇各1.5毫升分别洗涤神经元培养物一次，每次7分钟，随后用1.5毫升100%乙醇洗涤三次，每次7分钟。

接下来，制备环氧树脂并充分混合，置于真空环境中储存以去除气泡。将乙醇替换为50%环氧树脂乙醇溶液，在摇床中室温孵育30分钟，使样品浸透；随后更换为70%环氧树脂乙醇溶液，在摇床中室温继续孵育30分钟。

将环氧树脂溶液更换为100%环氧树脂，在50摄氏度下孵育10分钟。进行两次新鲜100%环氧树脂的更换，每次更换均在50摄氏度下孵育1小时。然后加入新鲜的100%环氧树脂，在50摄氏度下过夜固化，随后在60摄氏度下持续固化超过36小时。

随后，使用珠宝匠手锯从多孔板中取出每个样品。利用倒置光学显微镜，选择细胞密度较高的感兴趣区域。然后，将样品切成4×5×8立方毫米的组织块用于切片。随后，将切片浸入1%醋酸铀酰水溶液中染色15分钟，再浸入3%柠檬酸铅水溶液中染色5分钟，以提高样品的对比度。