外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像

本实验的总体目标是利用电子显微镜观察纯化后的细胞外囊泡的形态，并在细胞外囊泡内进行特定蛋白质的定位。该方法有助于解答细胞外囊泡研究领域中的一些关键问题，例如外泌体的分类及其内部特定蛋白质的定位。该技术的主要优势在于，可用于观察位于外泌体内部和外部的特定蛋白质分布情况。

该技术的意义在于确保多种疾病的诊断，包括癌症和细菌感染。尽管该方法可用于外泌体研究，也可应用于其他生物样本、微细胞培养以及特定蛋白质的定位分析。通常，初次使用该方法的研究人员会因免疫金颗粒的非特异性结合而导致污染问题而遇到困难。

采用标准技术在培养物中制备外泌体。然后对HCT116细胞的培养上清液进行超速离心，以沉淀培养基中的外泌体。沉淀完成后，小心移除培养上清液。

为固定纯化的外泌体沉淀，加入1毫升含2.5%戊二醛的0.1摩尔/升二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）。将脂质双层囊泡在4摄氏度下孵育1小时。随后，去除固定液，并用1毫升0.1摩尔/升磷酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物10分钟。

然后在4摄氏度条件下，用一毫升2%的四氧化锇对样品后固定一小时。去除固定液后，用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤外泌体沉淀三次，每十分钟更换一次缓冲液。随后将样品依次置于浓度梯度递增的丙酮溶液中，每种浓度振荡处理10分钟，以完成脱水步骤。

接下来，配制一份由三份丙酮和一份低黏度包埋混合液组成的溶液。用该混合液替换丙酮，并将样品孵育30分钟。随后逐步增加低黏度包埋介质的比例，每步均孵育30分钟。

最后，将外泌体沉淀物在室温下于100%低黏度包埋剂中孵育过夜。次日，使用包埋模具将样品包埋于纯低黏度包埋剂中，并在65摄氏度下烘烤24小时。使用超薄切片机制备厚度为60纳米的切片。

将切片置于镍网上，其中部分切片用2%醋酸铀染色20分钟，随后用柠檬酸铅染色10分钟。接着，将染色后的切片放入透射电子显微镜中，以80千伏电压观察样品，并根据曝光时间的自动设置进行操作。当观察到外泌体图像时，使用显微镜软件采集并保存图像。

首先，将含有60纳米厚未染色切片的载网置于50微升0.02摩尔甘氨酸溶液中孵育10分钟，以淬灭游离的醛基。然后，用100微升蒸馏水清洗切片，每次10分钟，共清洗三次。最后一次清洗后，将切片在含1% BSA的PBS溶液中室温孵育1小时。

然后，将载网置于50至100微升的抗KRS抗体液滴中，室温孵育1小时。接着，用含有0.1% BSA的PBS液滴，将载网洗涤5次，每次10分钟。随后，将载网转移至适当二抗的液滴中，在室温下孵育1小时。

现在，用含有0.1%BSA的PBS分别滴加于载网上，每次10分钟，洗涤5次。先在避光条件下用2%醋酸铀染色20分钟，再用Reynolds柠檬酸铅染色10分钟，对切片进行双重染色。将染色后的切片放入透射电子显微镜中，以80千伏的加速电压观察样品，并按照之前所示方法进行成像。

为了进行负染色，外泌体分离后，用一毫升 2% 多聚甲醛固定五分钟。将薄型、甲醛/碳膜包被的 200 目铜制透射电镜载网进行辉光放电处理一分钟，然后在载网上加载五至七微升外泌体悬液，孵育一分钟。若外泌体浓度过高，需将其稀释至适当浓度。

立即在电镜载网表面加入约20滴过滤后的1%醋酸铀溶液对外泌体进行染色。用滤纸接触载网边缘以去除多余的醋酸铀溶液，然后迅速用一滴水冲洗载网。使用一对镊子将载网放置于桌面上，并用培养皿部分覆盖载网。

将载网在室温下干燥10分钟，然后对载网进行成像，或将其存放在透射电子显微镜载网盒中以备后续观察。首先，对覆有薄层甲醛/碳膜的200目铜网进行辉光放电处理30秒。随后，将5至7微升用2%多聚甲醛溶液固定的外泌体样品加载到载网上，并在载网上孵育5分钟。

接下来，用100微升PBS清洗外泌体，每次10分钟，共清洗三次。将含有外泌体的载网置于50微升0.5摩尔甘氨酸溶液中处理10分钟，以淬灭游离的醛基。然后，将载网转移至含有1% BSA的PBS液滴中，封闭30分钟。

现在将载网与50至100微升抗PD-L1抗体在室温下孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。用五滴含有0.1% BSA的PBS分别洗涤载网，每滴10分钟。然后将载网转移至二抗溶液中孵育一小时。接着，再次用五滴含有0.1% BSA的PBS分别洗涤载网，每滴10分钟，随后用两滴蒸馏水分别洗涤载网。

完成后，用2%醋酸铀进行负染色，如前所述，并对样品进行成像，或将其保存在电镜载网盒中以备后续观察。此处观察到的外泌体形态是负染色的结果。这些外泌体呈现出典型的杯状形态，这是在干燥过程中可能产生的假象。

通过全 mount 免疫金染色可获得更多信息，例如外泌体中特定蛋白质的定位。此处白色箭头指示 PD-L1 的位置。在切片图像中，囊泡显示出腔样结构，这是外泌体的已知结构特征。

这些也可以通过免疫金染色来鉴定外泌体中的特定蛋白质。一旦掌握，只要操作得当，在经过简单的制备和切片后，即可对纤维状细胞进行免疫金染色。在此步骤之后，还可采用其他方法，如双重免疫染色，以同时确定两种不同蛋白质的定位。

每次实验操作后，该技术可用于细胞外囊泡领域，以探索活检样本中的疾病诊断。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定外泌体中特定蛋白质的定位。请注意，实验中所使用的固定剂溶液（如盐酸、多聚甲醛和四氧化锇）具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并佩戴乳胶手套。