使用共聚焦显微镜对斑马鱼幼鱼进行单神经元选择性激光消融

取一预热的琼脂糖溶液，其中含有表达脊髓运动神经元荧光蛋白的麻醉转基因斑马鱼幼体。

将幼虫转移至带有琼脂糖环的玻璃培养皿中。

使用显微镜将幼虫侧放。然后，让琼脂糖凝固，以固定幼虫。

加入含有麻醉剂的缓冲液以维持麻醉状态。

将培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，使用明场成像定位背侧脊髓区域。

切换至荧光模式以观察荧光标记的运动神经元。

确定细胞胞体的中央 z 平面，以实现精确的消融定位。

在尽量减少光损伤的同时，设置成像参数以实现高分辨率采集。

当目标 z 平面聚焦清晰后，使用聚焦的紫外激光对目标神经元区域进行消融。

激光能量会破坏细胞结构，导致荧光丧失和细胞死亡。不可逆的荧光丧失证实了精确消融，且未影响周围细胞。

使用可调移液器吸取一条幼虫，并让其沉降至吸头底部。将幼虫以最小液体体积滴入预热的琼脂糖中，然后连同琼脂糖一起吸取该幼鱼，并迅速将其排入预先准备好的玻璃底35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，使用标准画笔将幼虫或多个幼虫在琼脂糖中侧向摆放，使其身体和尾部保持平坦。

让包埋的鱼静置10至15分钟，直至琼脂糖完全凝固。然后，使用约2毫升含三卡因的卵水小心补充35毫米培养皿中的液体。将包埋幼鱼的培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，采用明场照明和40倍放大倍数，聚焦于动物脊髓的背侧。切换至适当的荧光设置，观察目标结构，以确认所有成像参数均符合后续消融实验的要求。

为了确定紫外激光消融的结构厚度，使用 Z 轴驱动通过手动上下调节焦距来确认目标结构的顶部和底部。手动记录将被消融的 Z 平面，例如细胞的中心位置。要执行激光消融，请点击软件菜单顶部的下拉菜单，启动 FRAP 向导。

在新窗口中，通过选择格式、扫描速度和平均次数来确定消融操作的图像参数。如果尚未选择消融的Z平面，请按下实时按钮并调节焦距，使荧光结构或目标Z平面清晰对焦。设置好基本图像参数后，进入漂白步骤以控制具体的消融组分，然后启动405纳米激光，用于漂白程序。

接下来，使用放大功能通过减小扫描视野来最大化所选 ROI 的漂白强度，从而最大化停留时间。在图像采集窗口中使用任意绘图工具选择一个或多个 ROI 进行消融。例如，使用直径约为 4 至 8 微米的圆形绘图工具靶向轴突起始段。

确定感兴趣区域（ROI）后，选择时间过程按钮，并确认对 ROI 进行扫描和消融的循环次数。根据需要选择漂白前和漂白后的帧，以便在漂白过程开始前及刚结束后获得整个图像的概览。

这些设置为研究人员提供了多层面的优化空间。通过调节激光功率、扫描速度、线平均次数、感兴趣区域的大小以及重复次数，该技术可在很大程度上灵活地对单个细胞施加应力或诱导其死亡。

在确定所有必要的消融参数后，点击“运行实验”并监测消融效率。有关更多细节，请参阅文本方案。