利用双光子显微镜在斑马鱼原肠胚中实现深度与空间可控的体积消融

在胚胎内部，细胞之间相互作用，交换化学和机械信息。研究这些相互作用的一种有效方法是杀死部分细胞，并观察其对邻近细胞造成的影响。本文所述方法可实现对细胞的精确消融，即使在胚胎内部操作，也不会损伤周围组织。

通过将第一束激光设置为消融波长820纳米，第二束激光设置为mCherry成像波长1,160纳米，来准备双光子显微镜。利用光路中的可移动反射镜，在扫描头的入口和出口处对准两束激光束，然后在820纳米处测量第一束激光的最大功率。将功率计置于物镜下方，关闭黑色腔室，将第一束激光功率设为100%。在功率计上开始数据采集，打开激光快门，测量输出功率，并计算达到300毫瓦所需的激光功率百分比。

将第一台激光器设置为GFP激发波长920纳米，功率设为7%；将第二台激光器功率调整为15%。激活绿色和红色通道的PMT检测器，并将绿色和红色通道的PMT灵敏度均设为65。将视野调整为400乘以400微米，图像分辨率为512乘以512像素，扫描频率为800赫兹。选择三维时间序列成像模式，然后创建文件夹并启用自动保存功能，以便每次采集后自动保存数据。

组装加热腔室并将其温度设置为 28 摄氏度。等待至少 10 分钟，使腔室和物镜充分预热。在荧光体视显微镜下，鉴定处于 70% 上胚层形成期且表达 GFP 的胚胎。

使用塑料巴斯德吸管，将三到四个挑选出的胚胎转移至涂有琼脂糖的培养皿中，并用精细镊子小心去除卵膜。取一个小玻璃瓶，加入一毫升含有2%琼脂糖的青霉素-链霉素胚胎培养基溶液，将该瓶置于预热至42摄氏度的干式恒温金属浴中。使用火焰抛光的玻璃吸管，将一个去卵膜的胚胎转移至小瓶中，注意不要将过多的胚胎培养基带入琼脂糖溶液中。

弃去移液管中剩余的胚胎培养基。吸取胚胎，并加入足量的琼脂糖以覆盖玻璃底培养皿的玻璃表面。将含有胚胎的琼脂糖吹打至培养皿的玻璃片上，确保胚胎不接触空气或培养皿的塑料侧壁。

然后，用琼脂糖填充载玻片周围的腔室。使用一根睫毛将胚胎调整方向，使目标区域位于上方。五分钟后，当琼脂糖完全凝固时，在载玻片上加入数滴青霉素-链霉素胚胎培养基。

将玻璃底培养皿置于加热腔内的物镜下方。在关闭腔室前，将物镜浸入青霉素-链霉素胚胎培养基中。移动滑块，将光路切换至目镜。

打开荧光灯。找到胚胎并将焦距调至其表面。关闭荧光灯，在闭合暗室前将光路切换至PMTs。

开始活体成像并定位轴旁中胚层。为获得良好的信号，调整激光功率。使用红色通道将载物台移动至胚胎最顶端，并将此位置设定为 Z 等于 0。

选择时间步长为一分钟，Z步长为两微米。将第一层设置在轴向中胚层上方15微米处，最后一层设置在轴向中胚层下方15微米处。记录10至15分钟的消融前影片。

在活体成像过程中，定位胚盾（polster）轮廓，然后使用电光调制器感兴趣区域（EOM-ROI）工具，绘制一个宽度覆盖整个胚盾、大小为20像素的矩形，并将该矩形置于胚盾中央。记录需消融的最高和最低层面的轴向位置，确保在任何层面上，感兴趣区域均不与卵黄细胞重叠。将载物台置于需消融的最低Z位置。

将第一台激光器的波长设置为820纳米，并输入先前计算出的功率百分比，以获得300毫瓦的输出功率。将成像频率设置为200赫兹，第一台激光器成像EOM设置为零。选择ROI Treat模式后，关闭EOM，并将处理设置为在零帧后立即开始。

将成像模式设置为延时成像，并关闭自动保存。在时间步长中选择快速模式后，调整处理帧数和帧数至对应目标深度的数值。开始成像。

采集的图像应为黑色，因为在电光调制（EOM）处理期间，光电倍增管（PMT）的快门处于关闭状态。接下来，将载物台向上移动至下一个Z位置，并同样进行消融。重复此步骤，直至到达polster的顶部。

消融过程完成后，将第一台激光器设置为920纳米，并调整至先前选定的成像功率。将第一台激光器的成像EOM设为100，并选择全视野模式。成像频率应为800赫兹，在以实时模式检查整个图像堆栈以确认每个层面均已消融之前，应关闭EOM。

确认消融完成后，选择“3D延时成像”作为成像模式。重新启用自动保存功能，并开始记录消融后40至60分钟的影像。在消融后影像中，检查靶向细胞是否被有效消融。

由于对极体的消融不应损害胚胎，因此可在受精后24小时观察消融胚胎的正常形态。在激光消融成功的情况下，表层组织不会因下层结构的消融而受到影响。处理强度过高或过低均会导致激光消融失败。

一个消融失败的示例显示，位于胚盾上方的细胞被消融，这可通过胚盾上方焦平面上的自发荧光碎片明显看出。另一次无效尝试中，细胞被漂白但未被消融，低荧光信号仍显示出完整的细胞轮廓。最后，由于激光处理不足，部分细胞甚至未被漂白。

气泡的形成是由于激光处理过强所引起的空化效应。在一次成功的消融实验中，每隔一分钟采集一次Z轴层扫图像，持续40分钟，同时记录细胞质中的GFP荧光信号和细胞核中的mCherry荧光信号。此外，在消融前后，对属于前半部分帽区（polster）的细胞核用洋红色圆点标记，并进行随时间追踪。

为了评估迁移的持续性，研究了消融前后细胞的运动方向自相关性。属于胚盾前部的细胞在消融前表现出持续的迁移运动，而在消融后这种持续性显著降低，表明集体定向迁移能力的丧失。正确校准激光并测量激光功率对于获得可重复的实验结果至关重要。

在消融后的首张成像图像上检查消融效率也至关重要。我们利用激光消融来探究细胞间相互作用在胚胎内细胞迁移过程中的作用。但该方法可轻松适用于许多其他需要精确消融细胞或组织（可能位于生物体较深部位）的研究问题。