通过Alexa Fluor标记技术可视化登革热病毒

本实验的总体目标是对登革病毒进行荧光标记，以用于显微镜研究。准备必要的缓冲液，利用蔗糖垫纯化登革病毒，并在标记缓冲液中重悬 Amy React Alexa Fluor 染料和登革病毒。使用100 µM的Alexa Fluor染料对登革病毒进行标记。

孵育一小时，然后用亚试剂终止标记反应。通过尺寸排阻柱纯化标记的登革病毒。通过蚀斑实验重新滴定标记后的病毒，并通过免疫荧光实验估测标记程度。

大家好，我是来自新加坡国立大学医学院毕业后进入DSO国家实验室的Sam Jang，目前在Wee博士的新兴传染病研究项目中工作。今天我将向大家演示如何使用胺反应性Alexa Fluor荧光染料对Denki病毒进行荧光标记，以用于成像研究。Alexa Fluor染料比常见的荧光素和罗丹明类染料具有更高的稳定性，且对pH的敏感性更低，因此非常适合用于病毒细胞摄取和内体运输过程的研究。

Alexa 染料标记的登革病毒将有助于理解登革病毒的致病机制。现在我们开始操作。在标记反应前，根据书面方案配制新鲜的标记缓冲液和终止试剂，并通过蔗糖垫纯化登革病毒，将适量纯化后的登革病毒加入微量离心管中的标记缓冲液中，使病毒浓度达到每毫升3亿个形成单位。

此步骤可按比例放大，适用于病毒的批量标记。在标记反应前，用标记缓冲液将冻干的Alexa荧光染料重新溶解至1毫摩尔浓度。

从这一步开始应尽量减少光照。为演示起见，将800微升1毫摩尔的Alexa荧光染料在轻轻用微量移液器吸头搅拌的同时加入稀释后的登革热病毒中，且不进行避光保护。

室温避光孵育1小时，每15分钟轻柔颠倒混匀一次。孵育结束后，短暂离心试管。用移液器轻轻吹打重悬沉淀后，取800 µL上清转移至新管，继续室温避光孵育1小时，每15分钟轻柔颠倒混匀一次。

同时，用 25 毫升 HNE 缓冲液平衡纯化柱。孵育一小时后，将标记的病毒上样至柱中，并开始收集穿流液。用 HNE 缓冲液填充柱子。

当所有标记的病毒进入基质后，弃去最初的2.5毫升流出液，收集接下来的2毫升标记病毒组分。将纯化的标记病毒在-80摄氏度下保存。通过空斑实验测定标记病毒的滴度。

在典型的实验中，应观察到病毒滴度下降不超过十倍。标记完成后，应进行免疫荧光检测以评估标记程度。为此，使用血细胞计数板对病毒细胞进行计数，并将适当体积的细胞加入生长培养基中，使细胞密度达到每毫升50,000个细胞。

在含有无菌玻璃盖玻片的四孔板中，每孔加入一毫升病毒细胞悬液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。从培养箱中取出培养板，吸除上清液，然后每孔加入含有约一个感染复数（MOI）的标记病毒，体积为100微升，在37摄氏度下作用10分钟。

移除接种物，每孔用 0.5 毫升 PBS 缓冲液洗涤。吸去液体，并重复此步骤两次。每孔加入 200 微升 3% 多聚甲醛，在室温下固定细胞 30 分钟。

用每孔 0.5 毫升 PBS 缓冲液洗涤细胞三次。在室温下用固定液处理细胞 30 分钟。用精细镊子从孔中移除盖玻片。

通过轻压盖玻片边缘去除多余液体。将其紧贴一张白色纸巾滑动。将盖玻片有细胞的一面朝下放置。

在一片石蜡膜上滴加25微升登革病毒E蛋白抗体，孵育于湿润 chamber 中，室温避光孵育1小时。随后将盖玻片转移至六孔板中，每孔加入2毫升洗涤缓冲液。

吸除上清液。最后一次洗涤后，重复上述洗涤步骤再进行两次。用精细镊子从孔中取出盖玻片。

通过将盖玻片边缘浸入以排出多余液体。将其在纸巾上轻轻滑动以吸去残液。将盖玻片有细胞的一面朝下放置。

将25微升Alexa标记的山羊抗小鼠二抗滴加到一张盖玻片上，置于湿盒中，室温避光孵育45分钟。孵育结束后，将盖玻片转移至六孔板中，每孔用2毫升洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次洗涤后均需更换缓冲液。最后一次洗涤后，从孔中取出盖玻片，并用去离子水冲洗一次。

用纸吸去多余液体。取8 µL封片液，滴于显微镜载玻片上，将盖玻片封片。将封片后的样本置于4 °C条件下静置过夜。

样本现已准备好，可用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。在盖玻片表面滴加一滴镜油，然后将样品固定在显微镜上，再滑动至显微镜载物台。

调节载物台，直至显微镜物镜与浸油接触。为获得清晰的图像，请使用 Zes Zen 软件关闭环境光源。点击目镜标签，通过显微镜目镜直接观察样本。

找到一个充满细胞的视野并调节焦距。现在切换到采集模式。为了最小化花青素荧光之间的串扰，分别为Alexa Fluor 488和Finite 4选择独立的通道。

将染料和采集设置用于顺序激发和检测。调节激光功率、增益和偏移，以确保图像曝光适中，既不过曝也不欠曝。采集图像后，使用共定位功能分析感兴趣区域。

重叠系数可用于估算Alexa Fluor染料对登革病毒的标记程度。对病毒感染细胞进行了简单的免疫荧光检测，通过标记病毒与抗E蛋白抗体染色的共定位情况可估算标记程度，重叠系数范围为0.65至0.80，表明约65%至80%的病毒颗粒被Alexa Fluor染料成功标记。为确保标记实验成功，关键步骤包括：配制标记缓冲液、使用新鲜配制的试剂，并在标记前重新溶解Alexa Fluor染料。

染料的使用浓度可根据您的具体需求进一步优化。这种用于标记登革病毒的水平面标记方法，有可能被改进以用于标记其他病毒。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的标记实验顺利成功。