猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定

该方法可通过检测宿主氨基酸反应中涉及的编码RNA、非编码RNA和病毒RNA的表达，以及病原体如何影响宿主生物学功能，从而帮助解答宿主-病原体相互作用研究中的关键问题。该技术的主要优势在于提供了一种优化方案，可从单份全血样本的珠蛋白减少型RNA测序文库中同时处理mRNA和非编码RNA。本技术将由本实验室的技术员Sarah Anderson进行示范。

首先在室温下以 50 20 × g 离心血液样本管 10 分钟。在生物安全柜中操作，移除上清液后，向沉淀中加入 8 毫升无 RNase 水。盖紧管盖，涡旋振荡直至沉淀完全溶解，随后在室温下以 50 20 × g 再次离心 10 分钟，以回收沉淀。

在生物安全柜中操作，弃去上清液，保留沉淀。为提取总RNA，首先用移液器向沉淀中加入300微升裂解结合缓冲液。涡旋振荡后，将每管中的混合物转移至新标记的1.5毫升离心管中。

加入30 µL miRNA提取试剂盒中的匀浆添加剂。涡旋振荡离心管，然后置于冰上10分钟。在通风橱内操作，将离心管从冰上取出，加入300 µL试剂盒中的酸性酚-氯仿试剂，再次涡旋振荡以充分混匀。

在室温下以10,000 × g离心5分钟后，小心地将水相转移至新离心管中。根据上一步获得的水相体积，向每管噬菌体水相中加入1.25倍体积的100%乙醇，并用移液器吹打混匀。为每个样品准备新的收集管，其中装有滤芯。

将约 675 微升裂解液-乙醇混合物移液至过滤柱中。在 10,000 ×g 条件下短暂离心，使液体通过滤膜。弃去滤过液。

重复将裂解液-乙醇混合物加入滤膜并进行离心，直至完全用尽。向滤柱中加入700 µL试剂盒中的洗涤液一。短暂离心，使溶液通过滤膜。

弃去穿滤液，保留相同的滤芯和收集管。向每个滤芯中加入500微升洗涤液二至三。再次离心后，弃去穿滤液，并重复洗涤步骤。

为去除滤芯中的残留液体，再额外离心60秒。将滤芯转移至新的收集管中。向每个滤芯的中心加入100 µL预热至95°C的无核酸酶水。

将 cartridges 在台式离心机上以最大速度离心约 20 至 30 秒。若需使用珠蛋白还原寡核苷酸进行杂交，首先通过将每个提取的样本加入 0.2 毫升无核酸酶的薄壁反应管中以变性 RNA。将反应管置于热循环仪中，70 摄氏度孵育 2 分钟。

随后，立即将离心管置于冰上，以获得最佳的 RNA 质量。在离心管冷却的同时，于一个 2 毫升离心管中配制 400 微升的 10X 珠蛋白还原寡核苷酸混合液和 10X 寡核苷酸杂交缓冲液。为配制杂交混合液，向每个 0.2 毫升薄壁、无核酸酶的反应管中加入 6 微克 RNA 样品、2 微升 10X 珠蛋白还原寡核苷酸混合液、1 微升 10X 寡核苷酸杂交缓冲液，以及无核酸酶水，使最终体积达到 10 微升。

将试管置于70摄氏度的PCR仪中2分钟。随后立即将试管置于冰上。进行RNase H消化时，首先用1× RNase H缓冲液将10× RNase H稀释至1× RNase H。

通过混合2微升10X RNase缓冲液、1微升RNase抑制剂、2微升1X RNase H以及5微升无核酸酶水，配制总体积为10微升的RNase H反应体系。将10微升RNase H反应体系加入珠蛋白减少杂交样品中，并充分混匀。在37摄氏度下孵育反应10分钟，随后冷却至4摄氏度。

向离心管中加入1 µL 0.5 M EDTA以终止消化反应，并将管内全部内容物转移至一个新的1.5 mL离心管中。随后立即向每个管中加入80 µL无RNase的水、350 µL裂解缓冲液，再加入250 µL 100%乙醇，并通过移液充分混匀。将每份700 µL样品转移至分别置于2 mL收集管中的洗脱滤柱中，以收集穿流液。

在8,000 × g或更高条件下离心15秒，然后弃去滤过液。将相同的洗脱滤芯放入新的2毫升收集管中。为清洗滤芯膜，向滤芯中加入500 µL温和洗涤缓冲液，在8,000 × g或更高条件下离心15秒。

弃去穿流液。然后，使用相同的收集管，向滤芯中加入 500 µL 80% 乙醇。在 8,000 × g 及以上条件下离心 2 分钟。

弃去流出液和收集管，保留洗脱离心柱。将每个洗脱离心柱放入一个新的2 mL收集管中。以最大转速离心5分钟，滤筒盖子保持打开，以干燥离心柱膜并防止乙醇残留。

弃去收集管后，将每个干燥的滤芯放入新的 1.5 毫升收集管中。向滤芯膜的中心直接加入 14 微升无 RNase 水。为洗脱 RNA，以最大速度离心管子 60 秒，随后继续进行后续的 RNA 检测与制备。

现在可以将珠蛋白耗竭的样本进行分装，用于制备小分子非编码RNA文库，以及核糖体RNA耗竭的mRNA和长链非编码RNA文库。采用本方案对珠蛋白耗竭和核糖体RNA耗竭的全血样本构建表达文库后，电泳文件运行汇总结果显示，珠蛋白耗竭文库样本的RNA完整性数值（RIN）介于6.3至9.2之间。与先前使用珠蛋白耗竭方法的研究相比，该结果有所改进，那些研究获得的RIN值仅达到或接近6。

单个猪全血样本在珠蛋白还原前和还原后显示，260至280纳米的浓度比值达到或高于2。采用本方案，获得了全血mRNA文库样本在合并与测序前经珠蛋白去除和核糖体RNA去除处理后的芯片电泳图谱。对于mRNA文库，代表性电泳图谱在约280个碱基对处出现峰值。

对于小的非编码RNA，具有代表性的基于芯片的电泳图谱包含约100至400个碱基对范围内的多个峰。约143个碱基对处的峰对应于miRNA，约153个碱基对处的峰对应于piRNA。在进行该操作步骤时，务必记住在标注处立即冰浴离心管。

完成此操作后，应进行其他方法，例如下一代测序，以回答更多问题，如差异表达、表观遗传学变化及其对生物通路和生物过程的影响。请注意，使用苯酚-氯仿试剂具有极高危险性，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作。此外，在处理全血或传染性生物体时，应在激活传染性生物体之前，在生物安全柜中进行操作。