使用共聚焦显微镜观察巨噬细胞外陷阱

本方法的总体目标是展示如何利用共聚焦显微镜对巨噬细胞胞外诱捕网进行可视化和研究。该方法有助于解答炎症领域中的关键问题，例如对感染及其他免疫刺激的反应。该技术的主要优势在于，它是在一种已被广泛用于研究中性粒细胞胞外诱捕网的成熟方法基础上进行的改进。

本实验操作由 Roleen Sharma 演示。根据文本方案，通过支气管肺泡灌洗（BAL）从人和小鼠获取肺泡巨噬细胞后，使用台盼蓝和血细胞计数板对 BAL 液进行活细胞计数。将 1 至 4 × 10⁵ 个巨噬细胞溶于 500 µL 培养基中，用移液器接种至 24 孔板内盖玻片上，每孔加样一次至四次，随后将细胞在 37°C 条件下孵育过夜，使细胞充分贴壁。

移除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。然后加入 2% 多聚甲醛-高碘酸盐-赖氨酸（PLP）固定液，孵育样品 10 分钟。用 PBS 短暂洗涤细胞后，加入含 0.2% TWEEN 20 的 PBS，孵育细胞 20 分钟。

接下来，为了封闭细胞，将10%鸡血清用PBS稀释至5% BSA中，加入样本并在室温下孵育30分钟。然后将封闭液替换为1:100浓度的一抗和同型对照抗体，于室温孵育1小时。孵育结束后，使用PBS洗涤细胞，再加入相应的二抗。

然后在室温下孵育样品 40 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，使用含 DAPI 的封片剂封片，随后用共聚焦显微镜观察样品。如需对 FFPE 样品进行抗原修复预处理，先将载玻片在 60 摄氏度的烘箱中干燥 60 分钟。

然后将切片转移至二甲苯溶液中处理30分钟，再将样本转移至室温下的70%乙醇中处理5分钟。用自来水冲洗切片后，将其置于耐热塑料膜中，并在压力锅中使用pH 9.0的Tris-EDTA缓冲液进行高温抗原修复10分钟。样本冷却20分钟后，转移至自来水中。

然后将它们置于摇床上5分钟。重复用自来水冲洗，再在摇床上用PBS冲洗载玻片一次。为封闭样品，加入含10%鸡血清的5% BSA PBS溶液，室温孵育30分钟。

然后，为了鉴定巨噬细胞的细胞外陷阱（即巨噬细胞外陷阱，METs），将一抗用含1% BSA的PBS溶液按1:100稀释，加入后于4°C孵育切片16小时。用PBS在摇床上洗涤样本两次，每次5分钟。加入相应荧光标记的二抗（溶于含1% BSA的PBS溶液），室温孵育切片40分钟。

经过 PBS 洗涤后，使用含 DAPI 的封片剂对染色质进行染色并封片。利用倒置显微镜连接的共聚焦激光扫描头，采用 20X 0.1 NA 干镜和 40X 1.0 NA 油镜采集荧光图像。通过点击“逐行顺序扫描”按钮，获取单层 512 × 512 像素的图像。

每个结果至少获取每张切片10个视野用于分析和数据采集。在微量离心管中对切片进行染色时，加入200微升体积的相关一抗，并在4摄氏度下孵育样品16小时。加入相应的二抗之前，用PBS洗涤切片3次，每次10分钟，然后在室温下孵育样品1小时。

使用 DAPI 对溶液中的肺组织切片进行染色，然后在 PBS 中的载玻片组织切片上加盖盖玻片前，将样品孵育 20 分钟。使用配备 405 纳米、440 纳米、473 纳米、543 纳米和 635 纳米激光器的倒置共聚焦显微镜，采用 40X 1.3 NA 物镜采集图像，并以最佳 Z 轴步进厚度（0.54 微米）记录三维 Z 层叠图像。最后，根据文本方案分析图像。

此处展示的是支气管肺泡灌洗（BAL）样本中 MET 的一个示例。最早可检测到的特征是细胞核向细胞边缘移动，如该早期阶段的 MET 所示，其形状大致呈球形。随后出现细胞外染色质及其他共表达的介质，例如 H3Cit 和颗粒状蛋白酶，如该更成熟的 MET 所示。

早期阶段的MET位于左上方，较晚阶段的MET位于其下方靠近中心位置。本图展示了肺组织中的MET。当肺部被液体充盈以显示肺部结构时，MET会被推至肺泡壁上。

METs 的形态也会因组织切片的切面不同而有所差异。用于肺组织样本的标准切片厚度为四到五微米。较厚的组织切片可进行多次成像，从而实现 METs 的三维观察。

此处展示了一例从小鼠肺组织切取25至35微米切片获得的三维图像。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成染色及成像。在进行该实验过程中，需特别注意洗涤步骤应轻柔操作。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如明胶酶谱法）来探究蛋白酶的表达等问题。该技术建立后，可能为研究炎症性巨噬细胞反应提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用共聚焦显微镜观察METs。

请注意，使用PLP可能存在危险，因此在进行此操作时，应始终采取佩戴手套和护目装备等预防措施。