自体血管内皮祖细胞接种技术及心血管器械在大型动物模型中的生物相容性测试

本实验的总体目标是利用自体血液来源的内皮祖细胞接种血管植入物，然后观察该治疗在大型动物模型中对血栓形成的影响。该目标通过采集猪的外周血样本来分离晚期生长型猪内皮祖细胞来实现。接下来，植入装置。

在我们的原理验证研究中，将自体PCs植入钛管内，然后将该装置植入猪的下腔静脉。结果显示，与对照组和发生闭塞的裸金属管相比，EPC植入的钛管保持通畅，显示出抗血栓形成的保护作用。

杜克大学外科致力于推动具有开创性和创新性的研究。以下展示是我们跨科室、跨学科推进医学发展的一个范例。EK博士一直带领团队致力于开发一种细胞接种技术，该技术可通过在血管器械的血液接触表面覆盖患者自身的前体细胞，从而预防血栓形成。

由于这些细胞来源于将接受植入物的同一患者，因此可避免免疫系统的排斥反应。我们的成功以及本文所述方法是大型团队共同努力的成果。血管外科的 Sean Gage、杜克大学医学院学生 Whitney Lane 以及我本人将演示手术植入过程。

接下来，我将介绍来自生物医学工程系的博士研究生 Alexander Janssen，他将详细为我们演示细胞接种的过程。我将展示如何在将钛管植入猪模型之前，用血液来源的内皮祖细胞进行接种。该方法作为概念验证，其相同的基本原理可应用于许多其他可植入装置，例如镍钛合金支架和机械循环辅助装置。EPCs 通过铺板猪血的单个核细胞组分进行分离，通常在约七天后出现。

可通过其典型的鹅卵石样形态加以识别。在培养中将 EPCs 扩增至总数为 900 万个细胞。用无血清培养基冲洗制备好的 EPCs 两次，注意在标记期间及之后尽量减少其光照暴露。

然后用荧光标记物 PKH 26 覆盖细胞，并记录所加溶液的体积。室温孵育 4 分钟。一分钟后，向染料溶液中加入等体积的猪血清以终止标记反应。

用完全培养基将合并后的溶液按1:1比例稀释。然后吸除液体，用完全培养基冲洗细胞3次，随后用不含氯化钙和氯化镁的DPBS洗涤2次。接着加入胰蛋白酶覆盖细胞，记录所用体积，并在37°C条件下孵育。

孵育三分钟后，使用显微镜检查细胞是否已脱落，如果已脱落，则加入两倍于之前添加量的胰蛋白酶中和溶液。将细胞悬液合并至同一离心管中，并使用血细胞计数板测定细胞密度。最后，离心收集细胞沉淀，并将细胞重悬于至少 4.5 毫升无血清培养基中。

手术准备完成后，使用15号手术刀片从第二组唾液腺开始沿中线切开，使用电凝术向头侧延伸至倒数第二组腺体，分离至腹膜筋膜层。

用蚊式钳提起腹膜，用梅茨钳小心切开腹膜，将膀胱外翻，于膀胱壁置入一根3-0薇乔线荷包缝线。在其中央做一穿刺切口，将16法式 Foley 导尿管插入切口。然后输注静脉液体，术中将尿量调节至至少每公斤体重每小时1毫升。

接下来，将扩大的小肠外置，并放置两个布尔氏手术拉钩以暴露腹膜腔后部，通过锐性与钝性分离辨认下腔静脉（IVC）。仔细游离下腔静脉周围组织。然后从右侧肾动脉近端至下腔静脉远端分叉处对血管进行充分剥离，裸露血管。

在分离下腔静脉（IVC）时需格外小心，因为即使IVC出现微小缺损，也可能导致动物迅速出血并失血死亡。应结扎IVC节段的所有侧支血管，尤其需仔细分离并结扎位于IVC分叉处近端的两条粗大的腰升静脉。通常在IVC后方可见一条较粗大的腰静脉。

游离该静脉并用血管环控制。现在，在与手术并行的同时，在开始此操作之前，先用内皮祖细胞（EPCs）接种植入物。钛管组织嵌入支架必须在无菌区域中完全组装并准备就绪。

在5 cc注射器中打开经气体灭菌的钛管组件。然后从5 cc注射器中取出活塞，但不要丢弃。将一个固定的吸引帽连接到注射器上。使用移液器将EPC悬液充满注射器。

然后重新装上活塞。取下帽盖，将注射器的吸引端插入装置的开放式硅胶管中，直至刚好紧密贴合，但不要进一步插入。通过缓慢推动细胞溶液，使其上升至头部组件的顶端，以排除任何气泡。

然后用诱捕帽封闭组件，并用胶带在无菌手套中将其封好。将整个组件插入机械加工的注射器 holder 中，并置于 37 °C 培养箱内。使用量规确保 seating chambers 处于水平状态，并让组件在缓慢旋转条件下孵育。

在结扎下腔静脉后立即继续手术，按每公斤猪体重给予100单位肝素。然后立即在下腔静脉和腰静脉远端以45度角夹闭下腔静脉，再夹闭近端。接着使用11号手术刀片和组织剪，在近端和远端血管夹之间做一条四厘米长的纵向静脉切口。

从下腔静脉（IVC）中抽出所有血液，并用无菌DPBS冲洗其内腔。随后将搭载EPC的植入物或裸金属对照物插入IVC中，以防止细胞干燥并排出空气。用含有氯化钙和氯化镁的DPBS填充IVC。

然后用4-0普鲁线连续缝合关闭静脉切口，并移除近端血管夹，通过少量回血排出下腔静脉内的空气。回血结束后，移除远端血管夹以固定植入物。将一条固定缝线缝入穿过静脉壁的PVC导管中。

使用 CT 针上的 OPDS 缝合筋膜。用两根 Vicryl 缝线连续缝合皮下组织。然后用缝钉闭合皮肤。

沿切口部位皮下注射最多 20 毫升 0.25% 布比卡因，以缓解疼痛，并用纱布和 Tegaderm 覆盖伤口。根据需要皮下注射氟尼辛和氧吗啡酮。停止麻醉，当猪苏醒后，在接下来的七天内将其送回笼中。

每24小时给予一次Atri作为抗生素预防用药，并确保术前贴敷的芬太尼透皮贴剂持续黏附达三天。三天后，取出坐位的钛管植入物并检查其内表面。在550纳米激发波长下，另一根管内发现一层融合的荧光标记细胞。

此外，使用血小板内皮细胞黏附标志物对切片细胞进行染色，以显示细胞边界。本实验可采用多种不同的染色方法。相比之下，在促血栓形成的低剪切力环境下，裸钛管植入物会在下腔静脉中完全闭塞。

如图像 A 和 C 所示，细胞接种的钛管见图像 B，经含峰值血液的分离程序处理后仍无血凝块。内皮祖细胞（EPC）在培养约七天后出现。在进行手术操作时，必须仔细且轻柔地游离下腔静脉（IVC），因为下腔静脉或其侧支的微小撕裂都可能导致猪只失血性死亡。通过该操作后，其他与血液接触的材料可快速实现内皮化，以防止血栓形成。

内皮型血管支架，例如利用我们的人体血管内皮祖细胞（EPCs），可模拟血管壁的天然内膜结构，有望在支架植入后防止再狭窄和血栓形成。我们的快速原位技术可在手术室或导管室内，于数分钟内利用患者自体血液来源的内皮祖细胞完成对血管内装置的内膜化，从而避免长时间的体外培养。

避免了设备本身的时间消耗，该技术因而可实际应用于临床实践。