逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

本实验的总体目标是在微流控装置中的细胞上沉积一层薄的胶原蛋白组装层。该过程首先通过甲基化修饰酸化后的天然胶原蛋白，以产生净正电荷的胶原蛋白分子；第二步是通过酰化修饰酸化后的天然胶原蛋白，以产生净负电荷的胶原蛋白分子。

接下来，制备微流控装置并接种肝细胞，使其贴壁并过夜伸展。最后一步是通过交替将细胞暴露于带正电荷和带负电荷的胶原溶液中，在细胞层上方形成10层胶原双层结构。最终，通过相位差显微镜和免疫荧光显微镜观察，以及白蛋白和尿素测定，来验证细胞极性的建立与维持以及分泌功能的表现。

该技术的主要优势在于，它能够利用与过去二十多年中在培养板上应用的技术相似的方法，在微流控装置中实现肝细胞的培养。该方法无需复杂的装置设计，且所沉积的基质非常薄，厚度约为100纳米。我们最初是在探讨如何将经典的细胞培养技术从培养板转移到微流控装置时，提出了这一方法的构想。

胶原蛋白三明治法可在开放式顶面显微系统中应用，但所用的水凝胶与通道高度受限的封闭式微流控装置不兼容。取100毫克天然酸化胶原蛋白溶液，用冰上预冷的无菌水稀释至浓度为0.5毫克/毫升，并将溶液置于冰上以防止凝胶化。接着，用几滴1摩尔氢氧化钠将胶原蛋白溶液的pH值调节至9到10之间，并在室温下轻轻搅拌30分钟。

随着胶原蛋白沉淀，溶液将开始变得浑浊，于3000 × g离心25分钟以收集沉淀的胶原蛋白溶液。离心后，应在管底观察到清晰的凝胶状沉淀物，吸除上清液，然后将沉淀的胶原蛋白重悬于200毫升含0.1 N盐酸的甲醇中，在室温下搅拌反应四天以进行甲基化反应。甲基化反应完成后，于3000 × g离心25分钟，使甲基化的胶原蛋白形成沉淀，随后吸除并弃去酸化的甲醇上清液。接下来，将甲基化的胶原蛋白溶解于25毫升无菌PBS中，并通过60微米细胞滤筛过滤溶液。

使用1 N氢氧化钠溶液，每次加入20 µL，将溶液的pH值调节至7.3至7.4。使用商用大鼠胶原蛋白ELIZA试剂盒或羟脯氨酸检测试剂盒测定胶原溶液的浓度。随后用无菌PBS将溶液稀释至3 mg/mL。

将甲基化胶原蛋白溶液转移至带螺口盖的玻璃瓶中，通过以下步骤对其进行灭菌：在瓶底小心地加入三毫升氯仿，并将瓶子在四摄氏度下静置过夜。次日早晨。

无菌条件下，移除上层甲基化胶原层。将甲基化胶原储存于 4°C，并在一个月内使用。另取 100 毫克天然酸化胶原溶液，用冰冻的无菌水稀释至浓度为 0.5 毫克/毫升，并将溶液置于冰上以防止变性；如前所述，用氢氧化钠调节胶原溶液的 pH 值，并在室温下搅拌溶液使胶原沉淀。

接下来，将40毫克六亚甲基二异氰酸酐溶解于10毫升丙酮中。在搅拌的同时，将此混合液以每次0.5毫升的增量缓慢加入胶原溶液中，并持续监测溶液的pH值。当pH接近9.0时，加入一至两滴1 N氢氧化钠，以维持pH高于9.0，并在室温下持续搅拌120分钟。

加入全部六份氰化物和氢化物溶液后，观察混合物逐渐变澄清，此时琥珀酸胶原蛋白溶解；持续定期检测 pH 值，确保其保持在 9.0 以上。当所有琥珀酸胶原蛋白完全溶解后，使用 20 µL 增量的一当量盐酸将溶液 pH 值调节至 4.0。观察溶液再次变浑浊，此时琥珀酸胶原蛋白发生沉淀。

接下来将溶液在3000 × g 条件下离心25分钟。沉淀琥珀酰化胶原，弃去酸化上清液。用未反应的琥珀酸酐处理后，将琥珀酰化胶原在25毫升无菌PBS中通过反复吹打重悬，使其终浓度约为3毫克/毫升。然后将溶液通过60微米细胞筛过滤，随后调节溶液pH值至7.3至7.4之间。

使用 20 微升的一当量氢氧化钠溶液，通过商用大鼠胶原 ELISA 试剂盒或羟脯氨酸测定试剂盒评估该溶液的浓度。然后将溶液稀释至 3 毫克/毫升。使用无菌 PBS 以与甲基化胶原溶液相同的方式对该胶原溶液进行灭菌。

首先，采用标准技术制备一种微流控装置，该装置具有细胞培养腔室，其通道高度为100微米，宽度为0.4至1.5毫米，长度为1至10毫米，用于细胞生长。使用等离子清洗仪对装置表面和玻璃载片进行氧化处理，然后将两者压合在一起以形成键合。

将装置置于紫外光下照射至少30分钟以灭菌后，向腔室中加入含15微克/毫升纤连蛋白的无菌PBS溶液，并在37摄氏度孵育45分钟。随后，按照随附文本方案中所述，用细胞接种该装置。

在层流超净工作台中，为每个装置分别准备足够进行10次应用的甲基化胶原蛋白溶液和去甲基化胶原蛋白溶液，以及少量（数微升）培养基。将溶液置于冰上保存。交替使用20微升的甲基化胶原蛋白溶液和去甲基化胶原蛋白溶液对装置进行冲洗。

每次施加溶液之间间隔一分钟。每种溶液冲洗装置共10次。在胶原蛋白层生长过程中，应迅速操作以尽量减少细胞无培养基的时间；此时可观察到胶原蛋白在微流控装置的入口和出口处缓慢积聚。

如果流体流动阻力增加，用培养基冲洗装置一至两次，然后继续铺层。所有层铺完后，用新鲜培养基冲洗装置两次，并放回培养箱。甲基化和乙酰化会改变胶原分子的电荷特性。

胺化作用可去除带正电荷的基团，并替换为带负电荷的基团，而甲基化则去除带负电荷的基团，形成整体带正电荷的分子，从而实现两种胶原蛋白变体在带电表面（如细胞）上的逐层沉积。在微流控装置中，接种于纤连蛋白包被玻璃表面的原代肝细胞可通过逐层组装方式进行包被。胶原基质的组装——在细胞上沉积10个双层结构，可形成厚度约为140纳米的胶原层；而无顶层胶原逐层结构的肝细胞则不具备该结构。

随着时间的推移，基质中的细胞会失去其分化表型，发生收缩并从微流控装置表面脱落。相比之下，覆盖有超薄胶原层的肝细胞可维持其分化形态，在14天内保持超过90%的存活率以及细胞极性。除了细胞存活率、形态和极性外，胶原逐层组装技术还能恢复并稳定原代肝细胞的功能，如本视频所示。观看本视频后，您应能够充分理解如何对胶原进行甲基化和琥珀酰化处理，以制备带净正电荷和净负电荷的胶原溶液，并掌握如何将这些溶液用于逐层沉积法，在微流控装置内的细胞表面构建超薄胶原结构。