在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

本方案使研究人员能够以清晰且易于追踪的方式研究血管网络的形成过程，为新研究开辟了道路，并揭示了血管行为的机制。该技术有望构建出高度有序且可重复的血管网络，且这些网络能够响应周围环境。通过该系统，可获取患有血管疾病患者的内皮细胞，从而实现血管疾病的体外重建，并有助于寻找合适的治疗方法。

该方法可与不同类型的细胞联用，用于研究血管网络的行为，从而观察发育中的血管与特定组织类型之间的相互作用。首先将支架浸入70%乙醇中至少15分钟，然后用PBS洗涤两次。每块待接种的支架，用1.5微升纤连蛋白储备液与28.5微升PBS混合。

配制一份纤连蛋白稀释液，用于所有支架，以避免移液误差。将支架稀疏地放置在疏水表面之上，并在每个支架上覆盖30微升纤连蛋白稀释液。盖上培养板盖，将覆盖有纤连蛋白的支架置于37摄氏度、100%湿度的培养箱中，孵育至少一小时。

孵育后，用 PBS 轻轻冲洗支架，以去除纤连蛋白残留物。支架可在 4°C 的 PBS 中保存长达一周。通过将基础培养基与相应的培养基试剂盒组分混合，制备内皮细胞（EC）培养基，具体包括抗生素溶液、FBS 以及制造商指定的内皮细胞生长补充剂。

用内皮细胞培养基制备人脂肪微血管内皮细胞悬液，细胞浓度为每毫升四百万个细胞。用镊子将一个经纤连蛋白包被的支架放入非组织培养处理的24孔板的每个孔中。在每个支架上覆盖25微升的细胞悬液液滴，注意确保悬液不会从支架上流走。

将培养板盖上盖子，放入37摄氏度、5%二氧化碳和100%湿度的培养箱中孵育60至90分钟。孵育结束后，每孔加入700 µL内皮细胞培养基。继续培养内皮化支架，直至通过荧光显微镜观察到内皮细胞融合，或培养三天为止。

每隔一天更换一次培养基。通过混合500毫升低糖DMEM、57.5毫升FBS、5.75毫升非必需氨基酸、5.75毫升GlutaMAX以及5.75毫升青霉素-链霉素-制霉菌素溶液，制备DPSC培养基。将内皮化的支架转移至新的非组织培养处理的24孔板中。

使用移液器或真空抽吸装置弃去当前培养板中的所有培养基，注意避免将真空直接施加于支架上。将一个支架置于每个孔的中央，然后用轻微真空干燥周围区域。用 PBS 将凝血酶和纤维蛋白原储备液分别稀释至终浓度为每毫升 5 个单位和每毫升 15 毫克。

将八百万个DPSC每毫升的细胞悬液加入凝血酶稀释液中，按每块支架12.5微升的量分装至各自的微量离心管中。将5至50微升移液器设定为12.5微升，并吸取纤维蛋白原溶液。不更换枪头，将移液器调整至25微升。

吸头内的液体应上升并留出空余体积。缓慢按压推杆按钮，直至液体到达吸头开口处，但不渗出。保持推杆在此位置，将吸头插入含有凝血酶悬浮细胞的微量离心管之一中，确保吸头与液体接触。

轻轻松开活塞按钮，将细胞悬液吸入枪头中。充分混匀两种材料，避免产生气泡。迅速将混合材料滴加到已内皮化的支架表面。

对每个支架重复上述步骤，注意每次使用后更换枪头，以避免枪头内意外形成纤维蛋白凝胶。更换培养板盖后，将支架置于37摄氏度、5%二氧化碳及100%湿度条件下孵育30分钟。孵育结束后，向每孔加入1毫升1:1混合的牙髓干细胞与内皮细胞培养基。

培养一周，每隔一天更换一次培养基。在培养期间的不同时间点，从孔中移除培养基，并使用共聚焦显微镜对构建物进行成像，以研究血管发育或其他感兴趣的参数。该方案可用于制备由SU-8光刻胶制成的镶嵌式支架。

获得了具有不同隔室几何形状以及高度精确且可重复特征的支架。采用传统的内皮细胞与支持细胞同时接种方法时，细胞在支架上呈均匀分布，导致血管网络不可预测且无序。相反，分步接种细胞则形成了高度有序的血管网络。

使用荧光标记的内皮细胞时，可对血管进行实时成像。表达红色荧光蛋白的内皮细胞在六边形支架上培养并进行成像。在第1天加入支持细胞，并每隔一天对血管网络进行成像，以定量分析血管发育情况。

在每个时间点，均拍摄支架的整体宽视野图像。以血管总长度和面积来量化血管生长情况。通过共聚焦成像时间序列观察，利用多色内皮细胞对单个血管进行追踪。

通过延时成像生成了血管路径，从而可以观察血管的迁移过程。通过检测平滑肌肌动蛋白和支持细胞的存在来观察血管成熟情况。对于圆形、六边形和方形区域，细胞增殖并自组织形成结构。

到第7天时，所有形状均显示出丰富而复杂的血管网络。高倍镜图像显示，平滑肌肌动蛋白和支撑细胞在形成的血管周围共定位，密度更高，表明支撑细胞被募集并围绕血管结构发生分化。该技术可用于研究三维血管网络在不同条件下的行为，例如在特定细胞抑制剂作用下或存在其他细胞类型时的情况。