一种用于多肽表位定量分析的高通量MHC II类分子结合检测方法

本实验的总体目标是利用高通量384孔板检测方法，定量分析短肽与人类MHC II类免疫蛋白的结合能力。首先，对目标肽段进行溶液相竞争性结合实验；第二步，利用固定在高吸附ELISA板上的抗MHC II类抗体捕获已达到平衡的肽-MHC II类复合物。

接下来，将捕获的复合物与标记了链霉亲和素的鸦片类物质孵育，随后洗去未结合的链霉亲和素，并激活被捕获的鸦片类物质。最终，可通过时间分辨荧光测定法来定量分析MHC II类分子捕获的对照肽的水平。该方法可为目标蛋白的免疫原性潜力提供初步见解。

它特别适用于验证计算机预测的结果。首先，在384孔高吸附白色ELISA板的每个孔中加入25微升新稀释的L243抗体溶液，用聚酯膜密封该板，并在4°C下孵育过夜。随后，从每种待测物10毫摩尔的储备液开始进行后续操作。

使用3个96孔聚丙烯板，以柠檬酸磷酸盐缓冲液配制肽段和DMSO的以下稀释系列。注意：完整的3个96孔聚丙烯板需要三个独立的EIA板，如图所示。接下来，用15毫升锥形管将选定的MHC II储存液用反应缓冲液稀释至101纳摩尔浓度。

然后将对照肽从20 µM稀释至1:100的比例，加入新配制的MHC II主混合液中，并取21.5 µL含有对照肽的MHC II主混合液加入阳性对照孔中。将含有对照肽的MHC II主混合液以1:1的比例加入3个96孔聚丙烯板中的各个待测肽稀释液中，同时建立结合反应。最后，用聚酯膜密封反应体系，并将板在37°C、无二氧化碳控制的培养箱中孵育12至24小时，期间不进行振荡。

第二天，用中和缓冲液以1:1的比例稀释3个96孔板中的结合反应孔。然后用每孔60微升的PBS 0.05%洗涤ELISA板三次，每次间隔20秒。随后，将每个中和后的结合反应溶液从3个96孔板中各取25微升，每样本设三个复孔，转移至包被抗体的3个96孔板中。

将 ELIZA 板放入孔中，随后用聚酯薄膜覆盖，在 4°C 下孵育过夜。孵育结束后，按前述方法用洗涤液清洗 ELIZA 板三次，然后向每个孔中加入 25 µL 新鲜稀释的链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase）。用聚酯薄膜覆盖板孔，在室温避光条件下孵育一小时。

孵育期间，将每块板所需的10毫升增强液在避光条件下于室温平衡1小时；随后按所示方法洗涤ELIZA板，每孔加入25微升增强液，用聚酯膜覆盖后，在避光条件下孵育10至15分钟。最后使用时间分辨荧光酶标仪在设定的opium参数下读取荧光信号。在此代表性实验中，分析了肠杆菌Cloe P九九β-内酰胺酶的成熟肽序列，以筛选可能与MHC II类等位基因结合的肽段结合物。

在5%阈值下，仅鉴定出与MHC II类分子DRB*15:01结合所必需的、在第一位具有必需P1锚定残基的117种非肽类肽段。评分大于或等于2.6的肽段很可能是结合物。因此，在5%阈值下，仅预测前11种肽段能够结合MHC II类分子DRB*15:01。

选择了一组具有代表性的预测表位，用于本MHC II类分子结合实验的分析。这些15个残基的β-内酰胺酶肽段通过化学方法合成，使得假定的九肽MHC II类表位被包含在其合成的蛋白片段中。随后按照前述方法，分析这些合成肽段与生物素标记的髓鞘碱性蛋白B对照肽竞争结合MHC II类分子DRB1*15:01的能力。

合成肽的竞争性结合曲线如图所示。IC50值通过使用Prism软件中的一点竞争性结合非线性拟合函数对对数转换数据进行拟合而计算得出。如图表所示，这些肽自然分为三组：强结合肽（IC50小于1 μM）、中等结合肽（IC50大于或等于1 μM但小于100 μM）以及弱结合肽（IC50大于或等于100 μM）。在完成开发后。

该技术为分子免疫学和生物治疗设计领域的研究人员深入探索人类患者抗蛋白免疫反应背后的关键分子识别事件奠定了基础。