高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

本实验的总体目标是利用一种简单的高通量转染方案和自制的双荧光素酶检测方法，鉴定任意目的基因的转录调控因子。首先设计并克隆一系列独特的双荧光素酶报告质粒，然后将这些报告质粒与DNA表达文库中的质粒共同转染至96孔板中的293T细胞中，使每孔仅转染一种文库质粒。

48 小时后，检测萤光素酶活性，随后检测香草素酶活性。最后一步是计算萤光素酶与香草素酶活性的比值。最终得到目的基因在每种文库作用下的相对诱导水平。

基因的推断基于每个孔在基于孔板归一化后，海肾荧光素酶与香草荧光素酶活性的比值。该技术相较于现有报告基因检测方案的主要优势在于，能够以最少的人力和成本快速获得大量基因的功能数据。在转染前一日，即筛选的第一天，将293T细胞接种至96孔板中。

将细胞进行计数并调整浓度，使细胞悬液浓度为每毫升1.5 × 10⁵个细胞。在含有14%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中重悬细胞后，将其倒入无菌储液槽中。将储液槽、六个透明平底96孔板以及一盒带滤芯的移液器吸头放置于自动液体处理系统的机器人工作台上。

每个待筛选的文库板应准备两块细胞板。每块板的每个孔中加入100微升细胞，使细胞密度达到每孔1.5 × 10⁴个细胞。本演示中将筛选三块文库板。

因此，准备六块细胞培养板，在50 × g条件下以低加速度离心2分钟，以确保每孔中的细胞密度均匀。此图像展示了细胞板在离心后应有的形态。将细胞在37°C和10%二氧化碳条件下孵育过夜。

为制备萤光素酶和香草素报告质粒，将每种质粒用无内毒素水稀释至每微升含5纳克，置于15毫升锥形管中。按体积比5:3混合萤光素酶与香草素质粒的稀释液。用移液器将混合后的质粒加入96孔板的每孔中，每块文库板加17微升，并在每孔中额外加入2至10微升，用于在筛选第二天进行细胞转染。

对于每块文库板，首先在聚苯乙烯管中将107.5 µL室温下的OptiPrep缺陷液与4.3 mL无血清培养基混合，配制成1:40稀释液，在室温下孵育5分钟，然后将44 µL混合液分别加入96孔聚苯乙烯V型底板的每个孔中。将文库DNA板、稀释后的OptiPrep板、报告质粒板以及一盒移液器吸头放置于机器人操作台上。依次吸取17 µL报告质粒、43 µL稀释后的OptiPrep溶液和26 µL文库DNA，在每次吸取之间插入5 µL的空气间隙。

应最后吸取文库DNA，以防止交叉污染。将枪头中的内容物加入新的聚苯乙烯V型底板中，盖上盖子并静置20分钟，使脂质体-DNA复合物形成。若需转染多个文库板，在20分钟后更换移液枪头和文库板并重复操作，打开opt effect DNA混合板，将其与两板293T细胞一同放置于机器人载台上，使用同一盒移液枪头操作。

吸取80微升光遗传效应DNA混合物，每孔缓慢加入40微升，用于每块细胞培养板。在所有培养板的细胞中加入光遗传效应DNA混合物后，盖好细胞培养板。将培养板在1,200 ×g 条件下离心30分钟。

将培养板放回培养箱，继续培养细胞 4 至 6 小时。在此期间，通过混合含有 10% FBS 和 10 µg/mL 环丙沙星的 12 mL DMEM 制备新鲜培养基。对于每块转染文库板，将新鲜培养基倒入无菌储液槽中。

接下来，将两盒机器人吸头、一块细胞培养板、含有新鲜培养基的储液槽以及废液储液槽放置到机器人工作台上。然后，从细胞中吸取100 µL培养基，并排入已部分装有70%乙醇的废液储液槽中。使用新的吸头吸取100 µL新鲜培养基，缓慢加入细胞中。

将培养板放回培养箱中孵育48小时。随后进行萤火虫荧光素酶和香草荧光素酶检测。在筛选的第四天，即转染后48小时，针对每块文库板，分别从相应的储备液中配制8毫升3倍萤火虫检测缓冲液和12毫升3倍香草检测缓冲液；将82微升萤火虫检测缓冲液加入每块待检测文库板的96孔V型底板的每个孔中。

同样，将122微升香草测定缓冲液分别加入另一块96孔V型底板的每个孔中。对于每一块待测定的板，均需预留两种测定缓冲液。在机器人操作台上放置一盒移液器吸头、一个废液储槽，以及来自同一文库板的两块转染细胞板，从每块板中吸取60微升培养基，并弃入预先加入70%乙醇的废液储槽中，然后盖上板盖并暂置一旁。

接下来，在机器人工作台上放置两盒移液器吸头、三份萤光素酶检测试剂缓冲液以及一组细胞培养板。吸取40 µL三倍浓度的萤光素酶检测试剂缓冲液，加入第一块细胞培养板中，并充分混匀。

更换新的移液器吸头，对第二块细胞培养板重复上述操作。将细胞在室温下放置 10 分钟，以完成裂解。

使用光度计记录每块细胞板每个孔的发光信号，每孔记录1秒钟。将板放回机器人工作台。在机器人工作台上放置两盒移液器吸头、三倍体积的检测试剂缓冲液板以及一组细胞板。

吸取 60 微升三倍香草素检测试剂缓冲液，加入第一块细胞培养板中。充分混匀。更换新的移液器吸头盒。

对第二个细胞板重复上述操作。使用光度计记录所有板的发光信号，每个孔记录一秒钟。

这些表格展示了单个半板典型的荧光素酶值。每孔的萤火虫荧光与海肾荧光的比值（即 F2R 比值）通过将萤火虫信号计数除以海肾信号计数计算得出，结果如图 C 所示。图 D 显示了每孔的诱导值，该值通过将每孔的 F2R 比值除以整块板的平均 F2R 比值（排除最高和最低 25% 的孔）计算得出。对于单个转染文库板，诱导值应在重复孔之间取平均值。

诱导或抑制α-突触核蛋白表达超过三倍的基因为有效命中。请注意，在此代表性结果中，H2孔显示出32倍的诱导作用，该图展示了单个孔板的诱导值，其中H2孔以蓝色高亮显示。Hi.H2是一种神经元转录因子，此前未发现其与α-突触核蛋白表达相关。

重要的是要验证实验在报告基因检测的线性范围内进行，以确保导致表达升高的克隆能够被准确测量为荧光素酶活性的增加。为此，细胞被转染了不同递增量的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶质粒，这些质粒由强效的H-C-M-V-I-E启动子驱动，并进行检测。通过该方案观察到，萤火虫荧光素酶活性在较宽的数值范围内保持线性，而海肾荧光素酶活性在每孔超过15纳克时曲线趋于平缓。

孵育步骤后也应及时进行检测，以避免因底物耗尽导致的非线性结果。采用本方案，在添加试剂后长达一小时内的萤光素酶活性检测信号衰减时间进程显示，萤光素酶活性仍保持显著水平。在本研究展示的代表性结果中，共筛选了 7,670 个人类基因，最终鉴定出 68 个新的 α-突触核蛋白调控因子。每条水平线代表单个基因的诱导倍数，相对于对照的 GFP 中性诱导剂。

蓝色线条代表阳性诱导物，而唯一的红色线条代表抑制物。诱导值的计算方法是：以每个命中化合物处理下，α-突触核蛋白启动子驱动的萤火虫荧光素酶活性与CMV启动子驱动的ran荧光素酶活性的比值，再相对于使用GFP诱导物的相同荧光素酶构建体检测进行归一化。在此基础上，可进一步采用定量PCR以及过表达和敲低实验等其他方法，以确认所鉴定的命中化合物是否调控内源性靶标。