利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

生成不同亚型运动神经元的可能性对于模拟现代运动神经元疾病（如肌萎缩侧索硬化症）具有重要意义。该方法可在短时间内获得具有脊髓或颅脑特征、高度特异性的运动神经元细胞群体，且无需进行纯化步骤。在简化的培养条件下，由诱导性多能干细胞（iPSC）生成人类运动神经元，可能有助于推动针对运动神经元疾病的药物筛选。

通过诱导表达编程性转录因子，可从诱导性多能干细胞（iPSC）库中生成其他细胞类型，例如神经元、骨骼肌细胞和胶质细胞。在生成NIL和NIP iPSC细胞系时，先用不含钙和镁的PBS冲洗人iPSC培养物，然后在37摄氏度下用细胞解离试剂处理细胞5至10分钟。当细胞开始从培养容器上脱离时，使用P1000移液器轻轻手动吹打细胞3至4次，以实现解离。

将细胞转移至15毫升离心管中，加入不含钙和镁的新鲜PBS，调节终体积至10毫升，用于细胞计数。通过离心收集1×10⁶个细胞，并将细胞沉淀重悬于电穿孔试剂盒的缓冲液R中，体积为100微升。加入4.5微克转座子载体质粒DNA和0.5微克piggyBac转座酶质粒DNA进行转染。

根据制造商的说明，使用指定参数通过细胞电穿孔系统进行转染。随后，将细胞接种于添加了10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632的人iPSC培养基中，培养皿为6毫米基质包被皿。转染后两天，向培养基中加入5微克/毫升杀稻瘟菌素，使细胞持续暴露于该抗生素中至少7至10天，以消除未整合外源基因的细胞。

孵育结束后，将稳定转染的细胞作为混合群体进行维持，该群体由含有不同数量转基因和不同整合位点的细胞组成，或分离单克隆。另准备一培养皿，通过每微克/毫升多西环素诱导，以评估转基因的有效表达，并使用针对神经原性基因-2的转基因特异性引物通过RT-PCR进行检测，方法如前所述。在此阶段，还应将新型NIL和NIP诱导多能干细胞（iPSC）系的储备样本使用人iPSC冻存液进行冻存。

对于运动神经元分化，使用解离试剂将稳定转染的细胞培养物进行解离，以便将细胞收集至含有五倍体积DMEM/F12培养基的15毫升离心管中。离心后，将细胞重悬于添加了微摩尔浓度ROCK抑制剂的人iPSC培养基中进行计数。将细胞以每平方厘米6.25×10⁴个细胞的密度接种于基质包被的培养皿中。

接下来两天，将上清液更换为添加了多西环素的新鲜分化培养基。第二天，将培养基更换为添加了γ-分泌酶抑制剂、血管内皮生长因子受体抑制剂和多西环素的Neurobasal B27培养基。第五天，按所示方法消化细胞，并将脱落的细胞重悬于4 mL DMEM/F12培养基中进行计数。

移液对于细胞的完全解离至关重要。根据制造商说明书，使用细胞冻存液将一份等量的运动神经元前体细胞冻存，并通过离心收集其余细胞。将沉淀重悬于添加了10 µM ROCK抑制剂的神经元培养基中。

将细胞以每平方厘米1×10⁵个细胞的密度接种于多聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的微型载玻片支持物上，并加盖聚合物盖玻片。第6天时，小心更换为新鲜的神经元培养基，不添加抑制剂，继续培养至后续分析，期间避免细胞从支持物表面脱落。在第0天的分化细胞培养物中，可观察到多能性标志物八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）呈均匀表达，而泛神经元标志物神经元特异性Ⅲ类β-微管蛋白（neuron-specific class Ⅲ β-tubulin，TUJ1）呈阴性。

第3天时，OCT4阳性细胞数量显著减少，这一现象在部分正在分化的iPSC中表现为TUJ1的表达。到第5天，细胞群体中已无OCT4表达，同时TUJ1表达持续存在，并呈现出神经元样形态。

运动神经元前体细胞重铺后七天的免疫染色分析显示，TUJ1和成熟运动神经元标志物胆碱乙酰转移酶均呈均匀表达。由iPSC NIL衍生的神经元成功表现出电压依赖性钠电流和电压依赖性钾电流。在电流钳模式下，80%的iPSC NIL来源的运动神经元在注入+60皮安或更强的电流脉冲时能够产生动作电位串。

在记录的细胞中，引发超过50%细胞产生重复性放电所需的最小电流为+40皮安，峰电位阈值约为-38毫伏，在+40皮安电流下的平均放电频率约为8赫兹，表明由iPSC NIL衍生的脊髓运动神经元具有成熟神经元典型的功能特性。脊髓和颅脑运动神经元可由受控的iPSC或携带致病性突变的iPSC衍生获得，这些细胞可用于构建疾病模型或进行药物筛选。我们的方法有助于理解为何ALS（肌萎缩侧索硬化症）对不同的运动神经元单元产生差异性影响。