利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

该方法有助于回答发育性心脏力学生物学领域中的关键问题，例如利用4D光片显微镜通过Notch信号通路研究剪切应力对心脏小梁结构形成的影响。该技术的主要优势在于，它使用5微米厚的光平面照射样品的薄层区域，从而减少光漂白和光损伤。此外，我们的计算算法使我们能够重建出跳动的斑马鱼心脏的4D图像。

该技术的应用前景涉及先天性心脏病的诊断，因为它能够在发育早期到后期表型的整个过程中，对心脏小梁结构进行活体连续可视化观察。通常，初次接触该技术的研究人员会发现，随时间变化的三维思维难以想象。此外，构建该系统并实现精确对齐需要耗费一定时间。

首先，使用隔板将繁殖用的斑马鱼按雌雄分开置于繁殖缸中。随后，提起隔板，使雌雄斑马鱼交配繁殖。收集斑马鱼胚胎，并向胚胎注射吗啉代寡核苷酸以抑制小梁化过程。

接下来，通过将1克琼脂糖加入100毫升蒸馏水中并加热至琼脂糖完全溶解，制备浓度为1%的琼脂糖凝胶。待琼脂糖冷却后，使用20 µL移液器将一个已制备的胚胎与琼脂糖一同加入小塑料管中。将该管固定在显微镜载物台上，并使用10×物镜进行观察。

使用旋钮调节物镜，使胚胎顶部处于焦点位置。采用五微米的光片厚度，对整个鱼胚胎在多个心动周期内进行成像。采集500个xy平面图像，曝光时间为十毫秒。

然后，将载物台在 z 轴方向移动一微米至新的一层，并重复成像过程。每个 z 平面持续成像 500 帧，直至整个心脏被完全成像。接下来，打开图像处理软件，开始将图像堆叠成三维图像。

为此，请首先点击“打开数据”。在此处选择所有将要堆叠成三维的图像，然后选择“加载”。接着输入体素尺寸 0.65 × 0.65 × 1 微米，并点击“确定”。

输入正确的体素尺寸对于三维图像的准确分析至关重要。现在，单击多平面视图框以查看三维图像。右键单击蓝色切片的单点 tiff 框，选择显示，然后点击 volran。

在编辑菜单中，选择选项，然后编辑色谱图。通过色块调整颜色，然后单击确定。仍在图像处理软件中时，单击文件，打开时间序列数据。

选择刚刚通过点击“加载”生成的3D tiff文件，并输入与之前相同的体素尺寸。右键单击蓝色切片的单点tiff框，然后依次选择“显示”和“volran”。接着，点击“编辑”。

选择选项，然后选择编辑颜色图。使用色块调整颜色，然后单击确定。

接下来，右键单击时间序列控件，点击“电影制作器”，然后按下播放按钮以观看影片。最后，输入文件名、帧尺寸、帧速率、质量设为1，并选择单眼模式，然后单击“应用”。

最后，导出视频。生物力学力（例如血流动力学剪切应力）与心脏形态发生密切相关。在此，采用光片荧光显微镜对受精后75小时心室腔内突出的肌小梁嵴进行可视化观察。

受精后100小时，可清晰观察到小梁网络。在显微注射gata1aMO处理的胚胎中，造血作用和黏稠度降低了90%。这种黏稠度的降低减弱了血流动力学剪切应力，导致小梁网络的启动延迟且密度降低。

通过上调与Notch相关的基因表达，可以在受精后75小时和受精后100小时恢复小梁网络的延迟和密度，从而挽救心肌小梁的形成。因此，gata1a吗啉代寡核苷酸通过降低血流动力学力，导致Notch信号通路下调；而Nrg1-mRNA挽救实验则上调了Notch相关基因，重新启动了心肌小梁化过程。一旦掌握，该成像技术若操作得当，约需两小时即可完成。

该技术开发后，为心脏发育领域的研究人员提供了研究notch基因中调控斑马鱼心肌小梁正常形成的因子的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用选择性平面照明显微镜获取图像，并生成4D图像文件。请务必注意，激光操作可能具有极高危险性。

在此操作过程中，应始终采取适当的预防措施，例如佩戴合适的护目装备。