利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

本实验的总体目标是通过一种分区式微流控装置，对癌细胞的迁移进行直观观察和表征。首先，将已在无血清培养基中培养的脑肿瘤干细胞神经球解离；第二步，利用软光刻技术制备具有分区结构的双层SU-8模具，并以此制作PDMS印章。

接下来，组装微流控装置并接种脑肿瘤干细胞。最后，使用一体化显微系统实现对脑肿瘤干细胞迁移的长期延时成像。最终结果表明，脑肿瘤干细胞在通过超限域空间迁移时，呈现出一系列循环往复的形态学阶段。

与现有的Transwell Boyton小室等方法相比，该技术的主要优势在于微装置能够实现对细胞迁移过程的可视化观察、细胞的可控定位以及因子的精确递送。因此，微流控技术具备可靠、高效且成本低廉的单细胞筛选与导向特性。该技术的应用前景涵盖癌症转移与复发的治疗，因为对高迁移性细胞的单细胞分析可能揭示潜在的未来化疗靶点。

尽管该方法可为癌症系统的迁移行为提供研究依据，但也可应用于其他系统，如胚胎发育、免疫反应、伤口愈合以及器官再生。首先从BTSC来源的神经球细胞悬液开始。将细胞收集至15毫升锥形管中，在900 RPM条件下离心5分钟，但不可更快。

吸去上清液。然后将神经球置于0.5毫升预热的Accutase中，在37摄氏度孵育5至10分钟，使其解离。孵育结束后，用P100移液器轻轻吹打10至20次，机械性地分散细胞。

然后加入 1.5 毫升干细胞培养基以中和 Accutase，将细胞悬液在 1300 RPM 条件下离心五分钟，并用 1 毫升干细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板检测细胞密度，并将密度调整至每微升 20,000 个细胞。开始制备 SU-8 模具母版时，使用 Adobe Illustrator 设计并结合图像绘图仪将图案激光打印至透射胶片上，制备两张光刻掩模。

第一层光刻掩模包含两个对准标记和一组微通道，第二层光刻掩模则具有固定腔和接收腔。用异丙醇清洁两层掩模，并使其自然晾干。接着，在手柄晶圆上旋涂一层厚度为三微米的SU-8光刻胶，随后进行前烘。

然后将第一层光刻掩模与紫外光紧密接触，对光刻胶进行曝光并使其固化。随后进行后烘并显影已固化的晶圆。用透明胶带覆盖手柄晶圆上的对准标记区域。

然后在晶圆上旋涂250微米厚的光刻胶。之后，剥离胶带以露出用于对准的标记。涂覆第二层光刻胶，并对准基准标记。

然后对第二层光刻胶掩模进行紫外曝光并固化，接着进行后烘和显影。通过蒸镀法对SU-8模具进行硅烷化处理，以降低表面黏性。将晶圆放入干燥器中，并加入数滴三氯硅烷溶液，在真空条件下放置至少一小时。

随后即可使用该模具对PDMS进行 molding。首先，将预聚体基质与固化剂按10比1的比例充分混合，然后将混合物置于干燥器中进行真空脱气，直至看不到气泡为止。

将混合物倒入模具中，并再次脱气。如果引入了新的气泡，则将模具置于水平的加热板上，在 90 摄氏度下固化两小时。待其冷却至室温后，轻轻取下 PDMS 印模。

因此，细胞培养通道已雕刻在PDMS上，可随时用于微流控装置的组装。只要未出现裂纹或磨损，该模具可重复用于成型。当模具表面变粘时，可重新涂覆防粘涂层。

首先通过PDMS印章在微流控装置上制备进样口和出样口。使用穿刺活检钻孔器打孔后，将PDMS印章浸入70%乙醇中30分钟以进行清洁，随后用去离子水冲洗10分钟。通过高压灭菌法对PDMS印章进行灭菌并完成交联反应。

现在将PDMS印章放置在涂有多聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上。然后通过储液池入口向腔室中注入封片溶液，对装置进行封片处理，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天，从装置中吸除封片溶液。

然后用干细胞培养基将装置冲洗两次。现在将11微升解离的细胞加入其中一个接种储液池中。如有需要，可使用真空抽吸促使细胞进入腔室。随后，向相邻的沉降储液池中再加入7微升细胞。

五分钟后，座位区和接收储液区将充满培养基。现在将一片厚度为0.5至1毫米的无菌PDMS膜放置在装置上。PDMS与自身表面的自然黏附性会密封该装置，一旦密封完成，即可用于运输、孵育和显微成像。

通过运行45分钟使生物素化装置IM预平衡。为稳定其温度、湿度和空气供应，在样品室中加入数个盛水的培养皿以达到适当的湿度。将制备好的装置放入显微镜的样品室中。

使用微型镊子将装置置于中心位置。然后使用 Biot 软件设置焦距位置点和时间点，必要时开始延时成像记录。培养五天后，更换培养基。

在装置中接种的 BTCs 通过相差成像被持续记录。在培养腔室中培养五天期间，梭形细胞保持在迁移前阶段。当细胞接近微通道入口时，少数细胞发生伸展并产生黏附性突起。

只有一个细胞能够占据入口并探索迁移方向。一旦细胞确定了迁移方向，便会以稳定且较高的速度穿过整个微通道。在微通道末端，细胞会先探索接收室的开放空间，然后最终进入其中。

通过以每两秒一次的成像间隔观察细胞，发现细胞的迁移动力主要来源于类似于OID细胞的出芽样活动。在进行该操作时，需要注意该装置的设计具有高度灵活性，可通过调整微通道的尺寸来实现所需的细胞迁移程度。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建一种独特的可区室化微流控装置，用于培养您感兴趣的细胞，并在此基础上进行长期延时成像，从而对这些细胞的迁移特性进行定性和定量分析。

其他方法，如下一代测序或DNA微阵列，也可用于回答其他问题，例如高迁移性癌细胞在遗传上存在怎样的差异。