用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

本实验的总体目标是构建一种三维共培养模型，称为乳腺结构与微环境工程模型（mammary architecture and microenvironment engineering，简称 MAM），用于实时活细胞成像以观察细胞间的相互作用。该目标首先通过在盖玻片上包被经纤维母细胞降解淬灭的 I 型胶原（DQ collagen one）基质来实现。

接下来是淬灭型胶原D。第四步：在已固化的DQ胶原I以及含有包埋成纤维细胞的胶原I基质上，加入重建的基底膜基质。第三步中，将上皮细胞或肿瘤细胞悬液铺加在盖玻片表面，使细胞能够黏附于DQ胶原I及重建的基底膜基质上，随后加入培养基。

最后，使用共聚焦显微镜进行四维成像，该技术可在三个空间维度及时间维度上对活体乳腺共培养物进行图像分析。四维成像最终实现了对乳腺肿瘤细胞与肿瘤微环境中其他细胞之间动态相互作用的可视化与分析，这些相互作用可能影响向侵袭性表型的进展。与现有的方法（如活体成像）相比，该技术的一个主要优势在于，本模型中所观察到的细胞相互作用是发生于同一物种的细胞之间，即人类肿瘤细胞与人类肿瘤相关细胞之间，而非例如人类肿瘤细胞与小鼠基质细胞之间的相互作用。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为组装主要的核心培养物首先需要进行可视化观察，然后还需要具备一定的技巧和实践经验才能成功。开始操作时，先放置一个经过酒精灭菌的矩形塑料盖，将其滑入一个 35 毫米的培养皿中，或使用 IBI tree 35 毫米 μ 培养皿。

然后将所需数量的成纤维细胞与DQ胶原蛋白混合。接着，使用100微升微量移液器，小心地吸取70微升成纤维细胞-DQ胶原蛋白（I型胶原蛋白）混合基质，并将其均匀铺展在盖玻片的整个表面，随后将培养皿置于37摄氏度、无二氧化碳的湿化培养箱中孵育30分钟。待基质凝固后，再将其转移至37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中平衡10分钟。

然后将培养皿置于通风橱中，直至其降至室温。在固化的DQ胶原蛋白上加入60 µL的DQ胶原蛋白IV型重组基底膜基质，以及含有包埋成纤维细胞的I型胶原蛋白基质。然后用移液枪头小心地将DQ胶原蛋白IV型重组基底膜基质均匀铺开，注意避免刮伤成纤维细胞及下方的DQ胶原蛋白I型胶原蛋白基质。

然后将培养皿和盖玻片转移至含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育10分钟，期间DQ胶原IV型重悬基底膜基质正在凝固，同时消化细胞并计数，以用于共培养。现在，将50微升细胞悬液加入包被好的盖玻片上，再将培养皿放入37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育40至60分钟，使细胞贴附于DQ胶原IV型上。细胞贴壁后，向35毫米培养皿中加入2毫升含2%重悬基底膜基质的培养基。

然后在 PBS 洗涤后，于所需时间孵育，再进行成像。将共培养物在 MEGM 培养基中与 5 µM Cell Tracker Orange 于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 45 分钟。孵育结束后，再次用 PBS 洗涤共培养物，并将其在预热的 MEGM 培养基中于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续孵育 30 分钟后进行成像。在共聚焦显微镜上使用水浸物镜以低倍镜（例如 10×）观察活体共培养物，并在整个结构深度范围内以 10 µm 间隔采集光学切片。

使用光学切片，通过 Velocity 软件或类似程序对图像进行三维重建。对三维重建结果制作动态影像，以便可视化观察结构、细胞间相互作用以及细胞与周围基质的相互作用。在此代表性示意图所示的皮肤共培养模型中，首先将 IBI 多孔培养皿分别用胶原蛋白、含 DQ 胶原蛋白以及成纤维细胞（如图中品红色所示）进行包被。

然后加入含有DQ胶原蛋白四型的重建基底膜第二层。接着将红色的肿瘤细胞接种于其上，并覆盖2%的重建基底膜，在培养条件下进行培养。

用奶油色圆点表示的培养基在每次更换培养基时均被覆盖。DQ胶原蛋白I型和IV型的荧光切割产物以绿色表示。在本典型的MCF 10 DCIS与WS 12 TI共培养的23天过程中，此处及后续图中所成像的细胞（红色）发生了增殖，同时此处及后续图中也观察到DQ胶原蛋白IV型和I型的降解（绿色），以及共培养体系中胶原基质体积减少所提示的基质降解。

在23天内对相同的活体共培养物进行了观察，并在共培养的第3天、第16天和第23天通过共聚焦显微镜拍摄图像。Mame共培养物中的相互作用是动态的，并会随时间发生变化。例如，如本3D模型所示，在第3天的细胞Mame共培养中，细胞在此时刚刚开始在基质中增殖，仍处于相对稳定状态，这一点由缺乏绿色荧光得以证实。

然而，到第16天时，随着细胞持续增殖，它们已开始降解基质结构，这一点可通过DQ胶原蛋白观察到：绿色显示了一和四的裂解产物，而细胞对基质的主动降解则表现为基质与细胞共定位发出的黄色荧光。到第23天时，与第3天相比，快速增殖的细胞已降解了近一半的基质；第3天时共培养体积为110,000立方微米，而到第16至23天，该体积已减少至仅46,250立方微米。

16 共培养中，可观察到红色 DCIS 细胞表面 DQ 胶原四的蛋白水解，以及在白色成纤维细胞附近的区域中 DQ 胶原一的弥散性蛋白水解。该共培养中使用的差异染色方法还可在其发育后观察两种细胞类型不同的迁移和增殖模式。该技术为乳腺癌领域的研究人员探索肿瘤大环境对癌症进展的影响铺平了道路，并实现了对癌细胞与周围基质细胞之间动态相互作用的活细胞成像。