高通量膜蛋白结晶的脂质双层微碟法

本视频将演示一种利用脂质B细胞（Lipic B cells）建立高通量结晶实验的方法，用于纯化膜蛋白的结晶。首先制备B细胞，通过将脂质与去污剂混合，将纯化的膜蛋白掺入B细胞混合物中，然后使用纳升机器人进行结晶实验并进行视觉检测。通过标准光学显微镜观察可确认晶体的存在。

蛋白晶体形成后，可将其取出并冷冻，用于数据收集和结构测定。该技术的主要优势在于，由于B细胞具有独特的相行为，可利用实验室中常见的标准设备和机器人系统进行结晶。B细胞的制备方法十分简便，能够将目标膜蛋白从去垢剂胶束中分离出来，并将其置入类脂介质中。

这为您提供了全新的一组筛选条件。这种方法非常简单，已成功应用于多种膜蛋白，因此完全值得尝试。基于B细胞的结晶第一步是制备形成B细胞的脂质两亲性混合物。

该过程需要耗费大量精力，且最为耗时。请注意，完成该过程可能需要数小时。B细胞可在多种脂质两亲分子组合以及较宽浓度范围内形成。

有关建议的起始点，请参见随附书面方案中的表一。首先配制 1 毫升摩尔比为 2.8:1 的 35% DMPC 与 Chapso 混合液。具体操作为：在离心管中称取 0.26 克 DMPC 和 0.09 克 Chapso，用去离子水定容至 1.0 毫升，涡旋混匀该混合物。

接下来，将混合物置于水浴中加热至约 40 摄氏度，直至其变为凝胶状。然后将试管放在冰上。样品应再次恢复为液态。

然后再次涡旋数分钟，继续循环进行温育、冷却和涡旋操作，直至脂质完全溶解。注意随着循环次数增加，混合物在冷却完成后可能会变得浑浊。混合物在室温或更高温度下呈透明凝胶状，而在冰上则为黏稠液体。细胞可置于零下20摄氏度长期保存。

接下来将纯化的蛋白质加入B细胞培养基中。该过程较为简单，应与结晶步骤在同一天进行，结晶步骤将在视频的下一章节中展示。在室温下解冻DMPC capso B细胞混合物，直至其相变形成透明凝胶状。

将混合物置于冰上使其液化，然后短暂涡旋以重新形成均一的B细胞相。从此步骤开始，始终将B细胞混合物和纯化蛋白置于冰上，以保持B细胞处于液相状态，便于移液操作。

接下来，将B细胞混合物按1:4的体积比加入已纯化的去垢剂溶解的蛋白质中。然后轻轻吹打混匀，直至溶液变得澄清且均一。若出现气泡，可在台式离心机中短暂离心去除。

将混合物置于冰上孵育至少30分钟，以促进蛋白质被细胞完全吸收。此时，蛋白质-细胞混合物已准备好进行结晶试验。接下来将使用蚊式结晶机器人演示结晶试验过程。

将96孔V型底板置于冰上冷却。用移液器将蛋白-细胞混合物加入到孔板中，以确保溶液的黏度最小。在完成最终步骤前，始终将蛋白-细胞混合物置于冰上保存。

此处使用的机器人有五个平台。将含有储液槽的微孔板放在第三个平台上，将用于点加液滴的结晶盖放在第五个平台上。然后将蛋白质按细胞板放置在最靠近点加位置的第四个平台上。

这可确保蛋白质-细胞混合物是机器人最后吸取的成分，并立即释放。使用软件启动运行后，机器人将先吸取储液溶液，随后吸取蛋白质-细胞混合物，并将其以液滴形式分配至盖子上，以防止在分配过程中发生加热和黏度增加。切勿在程序运行结束后立即通过蚊子（Mosquito）系统将储液溶液与蛋白质-细胞混合物混合。

从仪器中取出细胞蛋白板并置于冰上。打开仪器盖子，将其倒扣在含有储存液的板上，使液滴倒置。将板在20摄氏度下孵育。

请注意，也可测试其他温度以观察晶体形成并进行优化。较高温度会诱导层状相的形成，其优势在于可将蛋白质预先组织成层状结构。可在4摄氏度至20摄氏度之间的温度范围内进行筛选。

低于四摄氏度的温度可能导致脂质在长时间内析出，需在第1天、第3天以及此后每周进行观察，使用标准光学显微镜评估晶体的形成与生长情况。图中显示的是在仅受攻击条件下观察到的针状晶体的明场图像和紫外图像。晶体未检测到荧光信号，表明该图像中为假阳性结果。

当使用甲基丙二醇作为沉淀剂时，形成了棒状晶体。该晶体显示出微弱的荧光，提示其可能为蛋白质晶体，但经X射线衍射分析发现其并非蛋白质。图中所示晶体为实验设置约四周后观察到的结果。

在紫外光下强烈的荧光表明这是蛋白质晶体。正如您在本视频中所看到的那样，一旦获得B细胞，便可将其直接与纯化的蛋白质混合，此后结晶过程几乎与标准的去垢剂法实验方案完全相同。

另一个显著的优势是能够通过特定脂质对B细胞进行掺杂以实现优化。该技术具有极高的灵活性，且使用极为简便，因此应将其应用于所有膜蛋白结晶研究项目中。