通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究

本实验的总体目标是确定膜蛋白通过电子晶体学进行结构解析的最优二维结晶条件。首先，在纯化过程中使用一种相容的去污剂，将蛋白质从天然脂双层中溶解出来。实验的第二步是向体系中添加外源性脂质，并通过透析去除蛋白质-脂质-去污剂混合物中的去污剂，从而在严格控制的条件下形成二维晶体。

该实验步骤的第三步是将样品快速冷冻，使其进入玻璃态。该实验步骤的最后一步是通过冷冻电镜收集数据。最终，通过对所获得的数据进行计算图像处理，可得到蛋白质的最终结构。

您好，我来自佐治亚理工学院生物学院。您好，我是蒂娜·德雷德。

我来自佐治亚理工学院化学与生物化学学院的贝里实验室以及生物学院的施密特·克雷实验室。我是佐治亚理工学院生物学院英格尔博格·施密特·克雷实验室的马特·约翰逊。今天，我们将向您展示一种通过电子显微镜评估二维手性组装试验的方法。

我们在实验室中使用该方案来鉴定和优化二维结晶条件。现在让我们开始：首先，制备覆盖有碳膜的400目铜质透射电子显微镜（TEM）载网上的负染样品。用移液器吸取两微升蛋白-脂质体样品，滴加到带有碳膜的TEM载网上，孵育60秒。

如果样品分布不均匀，可用移液枪头侧面轻轻拂拭。接着，用撕下的沃特曼四号滤纸碎片从边缘进行封闭。这样可确保在不过度去除蛋白脂质体的前提下有效去除液体，并有助于保护脆弱的碳膜。

转印后立即进行。30秒后，在网格边缘加入2微升1%醋酸铀染液，并从网格边缘吸去多余液体。如果样品中含有高浓度的黏性甘油或蔗糖（通常在10%至20%范围内），则在负染色前，使用不含甘油或蔗糖的缓冲液对网格进行数次洗涤，有助于醋酸铀染液实现适当的染色效果。

网格制备完成后，首先使用电子显微镜在低倍镜下观察样品，以评估膜的分布情况、形态特征以及整体网格质量。随后在高倍镜下获取图像，并对图像进行RIA变换，以识别二维晶体。开始观察时，将网格放入电子显微镜样品 holder 中，为初步了解膜的平均分布情况，可采用2000至10,000倍的中等放大倍数。

在实验记录本中注明膜的分布范围、形态和大小。使用CCD相机记录代表性视野。接下来，如有必要，使用约400至800倍的低倍镜观察样品，以获得载网的整体情况。

这可以提供有价值的信息，用于评估载网制备质量，揭示样品浓度、蛋白质分布不均、脂质体分布不均以及碳膜部分破裂等问题。在低倍或中倍放大下确定感兴趣的载网区域，然后使用高倍放大来评估不同膜中可能存在的有序结构。

在二维结晶实验的早期阶段，这一点至关重要。为了鉴定出具有规则排列区域且前景良好的蛋白脂质体，并在后续实验中验证其可重复性，需确定用于筛选二维晶体的最佳高倍率条件，起始放大倍数应选择在50,000至60,000倍之间。根据二维晶体的尺寸和晶胞大小，高倍率设置可低至30,000倍，也可高至80,000倍。

在此，于目标成像区域附近的区域，我们将焦距调至大约负 400 纳米或更大负值，以确认目标区域是否确实为膜结构。检查样品中是否存在碳膜、云母片或其他可能被误认为蛋白脂质体的人工假象。同时观察边缘特征，以识别典型的膜折叠形态和结构特征。

接下来，使用CCD相机检查目标区域。在最佳高倍率设置下采集CCD图像时，较小或主要为疏水性的膜蛋白的晶格可能无法通过直接观察CCD图像本身来识别。在此情况下，需对整幅图像进行在线傅里叶变换（Fourier transform，FT）分析。

然而，如果有序阵列较小，该傅里叶变换将包含大量噪声。为提高信噪比，应减小图像框的尺寸，移动缩小后的框覆盖图像区域，并执行实时傅里叶变换。调整实时傅里叶变换的伽马函数，以实现对有序阵列的最佳识别。伽马值过高会因噪声干扰而掩盖衍射斑点，而伽马值过低则会导致较弱的斑点无法被识别。预计在负染2D晶体中，当欠焦量为负400纳米时，其分辨率约为15埃。

预期可识别出一至三个衍射点阵。注意观察衍射点的锐利程度以及是否存在镶嵌现象。分子量约为18千道尔顿的膜蛋白二维晶体，其尺寸可达数微米。

在倒易空间图（FTS）上，清晰且易于识别的活动FT框移动表明晶格是连续的，无镶嵌性。对于具有更大可溶性结构域的较大蛋白质，可在透射电子显微镜-CCD图像采集系统的小屏幕上识别其晶格，但必须通过傅里叶变换（FT）来更准确地评估晶格质量，包括无序蛋白阵列FT中的镶嵌噪声等特征。脂质体可能被误认为微弱斑点，需据此判断这些斑点是由小蛋白质二维晶体产生，还是源于噪声。

移动实时傅里叶变换（ft）的框。如果斑点立即消失，则为噪声；但如果在即使很小的区域内保持不变，则很可能存在晶体，因为脂质晶体具有独特的形态特征和傅里叶变换图像。这些脂质晶体还可以通过图像的目视检查以及一致的晶胞尺寸来识别。

在初始试验中可能会出现沉淀。通过高倍镜检查可区分蛋白质沉淀与脂质聚集体。如果是脂质聚集体，则可能已经发生了重组，后续实验仅需调整参数以增大膜尺寸并形成有序结构，而无需在30,000至50,000 × 条件下再次诱导重组。

这些暗色结构的边缘表明它们是由不含蛋白质的膜组成的。在最佳条件下沉淀的样品将含有大量二维晶体。无需追求膜外观的均一性，因为最大且最有序的二维晶体将在数据收集中通过肉眼挑选。

当使用此类样品进行冷冻电镜数据收集时，可获得最大量的高分辨率图像，因此这类样品很容易被识别。在执行此操作时，我们将向您展示如何通过透射电镜筛选小型记忆蛋白的二维晶体。需要牢记的是，在筛选过程中务必全面细致，不要忽略任何有前景的结晶条件，因为至此您已经投入了大量时间和精力。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。