利用突变型甲硫氨酸tRNA合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

该方案能够以细胞类型特异性的方式标记蛋白质。这是首个提供此类可能性的技术，可在体外或体内进行。该技术的主要优势在于，可对已标记的细胞类型特异性蛋白质进行未鉴定状态下的纯化，或通过免疫荧光在原位进行可视化观察。

首先，通过加入裂解缓冲液来制备组织裂解液，缓冲液体积为组织湿重的12至15倍，并反复吹打组织直至充分匀浆。将此匀浆在75摄氏度加热15分钟以使蛋白质变性，然后离心样品，并将上清液转移至新管中。该样品可在负80摄氏度保存。

接下来，将匀浆后的样品用含有无EDTA蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液稀释两到三倍，用于烷基化。然后加入新配制的碘乙酰胺，使其终浓度为20毫摩尔。将样品在20摄氏度避光条件下孵育一至两小时。

重复碘乙酰胺添加和孵育步骤两次。按照制造商的说明准备色谱柱：首先涡旋震荡色谱柱，然后取下盖子，切去底部，并进行离心。

接下来，首先使用点击化学交换缓冲液平衡缓冲液交换柱，然后对所有烷基化样品进行缓冲液交换。为评估叠氮高丙氨酸的掺入情况，取40微升上述样品，加入磷酸盐缓冲液（PBS），使终体积达到120微升。随后通过涡旋振荡反应液20秒，建立点击化学反应体系。

按照指定顺序快速加入每种试剂后，将样品在4°C避光孵育过夜，并持续旋转。次日，将样品在17,000 × g离心5分钟，离心后可见略带 turquoise 色的沉淀。将上清液转移至新管中，并将样品在-80°C保存。

用于标记蛋白的纯化。将所有样品进行缓冲液置换操作，以去除游离炔烃残留物，使用中性亲和素结合缓冲液作为平衡缓冲液。随后，用结合缓冲液混合中性亲和素高容量磁珠，洗涤三次。

将混合物离心，弃去上清液，并重复此步骤三次。然后通过加入等体积的链霉亲和素干珠和链霉亲和素结合缓冲液，制备1:1的悬浊液。每份样品预留20至40微升作为纯化前裂解液，并于-20摄氏度保存。

测定样品的蛋白浓度后，将一毫克蛋白与40微升珠子悬液混合。将混合物在4摄氏度下孵育过夜，同时持续旋转，使标记的蛋白结合到珠子上。次日，通过离心收集上清液。

留取20至40微升上清液用于后续分析，其余部分于-80摄氏度冷冻保存。随后，加入预冷的中性亲和素洗涤缓冲液1，洗涤磁珠三次。每次洗涤均需沉淀磁珠并弃去上清液。

然后加入相同缓冲液，在4摄氏度下持续旋转孵育珠子10分钟，随后弃去上清液。使用中性亲和素洗涤缓冲液二和三重复洗涤两次，并用相当于所用干珠体积的中性亲和素洗脱缓冲液，在20摄氏度下孵育珠子30分钟，以洗脱发生点击化学反应的蛋白质。在洗脱过程中，将珠子置于恒温金属浴振荡器中，以每分钟1000转的速度保持悬浮状态，分两次进行洗脱，并合并两次洗脱液。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析点击反应。图中展示了经腹腔注射给予叠氮高正亮氨酸以及通过饮水给予叠氮高正亮氨酸的实验代表性图像。另一项实验提供了确定最佳二硫键生物素可裂解炔烃浓度的示例。

在此示例中，标记样本与对照样本之间的倍数变化在14 µM炔烃浓度下达到最高。此处展示了一个质谱结果示例，显示与对照样本相比，叠氮诺亮氨酸标记样本中存在明显的富集现象。该差异在总蛋白染色中已可观察到。

除了肽段强度的变化外，两种样本中还存在各自特有的蛋白质。该实验方案技术上较为复杂，必须严格遵循每一步操作，并使用适当的阴性对照、烷基化处理以及对非点击化合物进行充分的纯化和清洗。本方案的关键步骤在于：若研究人员希望研究蛋白质，可通过对纯化后的蛋白质进行质谱分析来鉴定；也可将蛋白质上样至凝胶，通过蛋白质印迹法（Western blot）对目标蛋白进行分析。

该方法能够标记特定细胞来源的蛋白质，在蛋白质张力研究或体外、体内蛋白质合成分析等方面具有广泛应用。