裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

以下实验的总体目标是定量测量酵母细胞中核内结构的组织方式，以及生长条件变化或突变对其造成的影响。该目标通过在可最大限度降低自发荧光的条件下将酵母细胞培养至对数生长期来实现。随后，将细胞置入显微镜观察用的培养室中进行显微观察。

然后拍摄图像以测量细胞中不同荧光标记结构之间的距离。获得的结果显示了非核结构组织的差异，这种差异取决于酵母培养物生长过程中营养条件的改变。该方法有助于回答表观遗传学领域中关于亚细胞结构组织或染色质与基因调控之间相互作用的关键问题。

将裂殖酵母和酵母接种到30毫升试管中的3毫升EMM培养基中。首先准备爱丁堡最低限度培养基（EMM），或含有氯化铵的EMM培养基，以降低自发荧光，而不是对培养基进行高压灭菌。使用0.2微米滤器对葡萄糖溶液进行除菌，然后将其加入已高压灭菌的培养基中。

在富含营养的YEA培养基平板上新鲜培养后，轻轻盖上试管盖，将细胞置于30摄氏度、225 RPM的摇床中培养。每天早晚使用血球计数板计数细胞，并稀释至适当密度，以保持细胞处于对数生长期两天。实验当天。

细胞应处于对数生长早期阶段，以应对氮饥饿。将细胞按照书面实验方案中所述步骤进行处理：通过离心将细胞收集至离心管底部形成一个沉淀，使用1.5毫升细胞悬液置于一个eend orph管中，在最大1.5 RCF条件下，先以两分钟离心，然后将管子旋转180度，再进行额外两分钟的离心。弃去上清液，仅保留10至15微升，用剩余的培养基重悬细胞，并加入一等分体积的、经滤膜除菌的、浓度为每毫升含一毫克的凝集素。

在盖玻片的角落加入五微升凝集素溶液，并在凝集素液滴中加入五微升培养物。为创建 S. pombe 细胞的生长腔室，用移液器吸取五微升 EMM 滴于洁净载玻片上，将带有培养物的盖玻片以 70 度角倒置在培养基上方，然后自上而下轻轻放下，使其落入 EMM 中，并用硅脂密封边缘。剪去 200 微升枪头的宽端，将窄端连接至 2 毫升注射器上。

用注射器吸取约一毫升硅脂。通过轻轻推动注射器活塞，在盖玻片边缘涂上一条细硅脂线，以密封成像生长室。首先使用明场成像来定位细胞并进行观察。

获得共聚焦显微镜的清晰图像。我们使用配备63倍油镜（plan apochromat）的蔡司LSM 700激光扫描显微镜，并设置16线平均平面扫描模式。将面积单位设为1至1.1，以获得0.8微米的光学切片。

使用激光扫描细胞，检测Alexa 488和mCherry或GFP。每种条件下记录足够数量的图像，以对60个细胞进行测量。更换新的生长室并使用新鲜细胞。

成像60分钟后，在Zeen Light Edition程序中打开一幅图像，测量同一焦平面上不同荧光团信号之间的距离。打开测量工具，调节光强和对比度以识别每个荧光信号的中心位置，例如纺锤体极体和核膜，并测量它们之间的距离。将数据转录至记事本表格中。

使用统计软件或统计检验方法（如 T 检验或 Mann-Whitney 秩和检验）比较不同菌株和处理之间的亚细胞距离的均值或中位数。在此示例中，菌株 PJ 1 18 5 在 EMM 培养基中培养，并取一份样品置于生长室中进行成像。然后取一份 PJ 1 18 5 的等分试样。

将培养物转移至EMMN培养基中，孵育15分钟后取样品放入生长室进行成像。使用测量工具测量基因座与纺锤极体之间的距离，以及基因座与核膜之间的距离。如图所示，在氮饥饿细胞中，基因簇从核膜向纺锤极体移动的距离与在含氮培养基中生长的细胞相比，存在统计学上的显著差异。

测量GFP与SBP之间距离的数据呈正态分布，因此可使用T检验比较平均距离。两个均值之间存在显著差异。测量GFP与NM之间距离的数据不符合正态分布，因此使用Mann-Whitney秩和检验比较中位数距离。

采用该程序后，两个中位数值之间存在显著差异。还可进行其他方法，如实时 PCR，以进一步探究基因表达水平如何与核内亚结构组织的变化相关联。