一种定量适合度分析工作流程

本实验的目的是以精确且高通量的方式，平行地在全基因组范围内获取微生物培养物的定量适应性数据。首先将微生物菌落在96孔板中构建成阵列文库，并培养至饱和状态，以此实现该目标。随后，将饱和培养物用水稀释，然后点样到固体琼脂平板上。

然后定期拍摄固体琼脂平板，直至微生物菌落生长达到饱和。最后，将每种培养物生长过程的时间序列照片转化为细胞密度的定量测量数据，并结合观察到的生长曲线与生长模型，总结出微生物适合度的定量指标。最终，可通过结果证明微生物菌株在携带不同突变或处于不同培养条件下具有不同的适合度，从而提供遗传相互作用的证据。

与现有的高密度固定方法（如 SGA 或条形码竞争实验）相比，该技术的主要优势在于其适合度测量更为准确。该方法有助于回答癌症药物研发领域中的关键问题，例如哪些基因和生物学过程在 DNA 损伤应答和细胞周期调控中起重要作用，以及如何理解并转化此类针对潜在药物靶点的基础微生物研究，应用于人类癌细胞的研究中。尽管该方法也可为端粒功能和可视化研究提供见解。

它也可应用于酵母生物学的其他领域，或任何适合表型可为微生物生物学研究提供洞见的领域。我们希望QFA能够应用于其他多种已建立阵列文库的微生物生物体。例如，大肠杆菌（povi e coli）、orilla surplus。从饱和的过夜培养物开始，在200微升体积的丰富液体培养基中培养多达96种独立的酵母菌株。

在96孔培养皿中，使用一个直径为八分之一英寸的96针手动复制接种器，先将其浸入100%乙醇中进行灭菌，随后过火灼烧，并放置冷却。在96孔板的各孔中加入200 µL无菌水，用涡旋振荡器重悬处于饱和状态的酵母培养物，并通过将灭菌后的针具浸入菌株中三次进行稀释。随后将针具浸入含有无菌水的孔板中一次，再次对针具进行灭菌，并待其冷却后，将其浸入稀释后的培养物中三次。最后将接种针转移至固体琼脂平板上。

在培养琼脂平板后，使用 s 和 p 机器人 SP 成像仪手动对平板进行成像，以实现自动培养。首先准备一个在固体琼脂上生长的独立酵母菌株的矩形阵列。在此示例中，起始菌株是将温度敏感的查询突变体与酵母基因敲除文库杂交所得的结果。

使用带有96针、针直径为1毫米的无菌针头工具的机器人，在SGA平板上培养代表384种独立酵母菌株四个重复的1,536个培养物，将其中384个菌株转移至4块96孔培养板中，每孔含有200 µL选择性培养基，并在20 °C条件下培养至饱和。为点样饱和酵母培养物，首先将其转移至液体处理机器人中，通过磁力摇床重悬于Resus溶液中，然后使用无菌96针机器人针头工具将培养物用200 µL无菌水稀释至约1:70。

在清洁并灭菌针具工具后，将稀释后的菌液点样到琼脂平板上。以384孔板格式，将平板转移至带有自动转盘和访问舱门的温控湿化培养箱中。使用机器人自动化成像仪对菌落进行成像，该设备会反复将平板从培养箱中取出，打开盖子，转移至35毫米相机下方均匀照明的空间，并以5,184 × 3,456分辨率拍摄图像。

像素分辨率替换盖子后，将其放回培养箱转盘，以追踪培养皿上的培养位置及施加的处理。培养皿会根据培养箱名称、温度、唯一的连续批次编号以及在培养箱中的位置自动进行条形码编码。图像名称由培养皿名称和时间戳组合而成，并在图像捕获时自动生成。

通常还需手动标记培养板，以确保在机器人转盘之间转移时保持相同的顺序。元数据文件为制表符分隔的文本文件，需手动生成。实验描述文件为 FT two。

每个实验的表格一都是唯一的，但文库描述文件FT三的表格一可广泛重复使用。实验构建完成后，需在实验描述文件FT二的表格一中进行描述，该表格包含以下列：条形码或自动生成的板名称、实验起始时间戳、板处理方式、固体琼脂培养基成分、筛选名称、文库板编号（适用于包含多块板的文库）以及重复象限编号（用于从1,536孔板格式缩小至384孔板格式）。e菌株文库需通过文库描述文件FT三的表格一进行描述，其中注明每个培养位置所对应的基因型。

每个文库的平板包含四列：文库名称、ORF、平板编号、行列位置，以及一个可选的备注列。可提供一个可选的标准基因名称文件（FT4，表1），用于描述与每个系统性ORFY编号相关联的标准基因名称，并标识正在筛选的菌株。该文件包含两列：ORF和基因名称，用于数据分析。

QFA 计算工作流程需要使用一台配置合理的多核计算机工作站。colonizer 图像分析软件工具和 QFAR 软件包均可在多种操作系统上运行，免费提供，并已在线提供详细文档。将每张采集的平板图像作为输入分别运行 colonizer，为每张采集的图像生成一个 colonizer 输出文件 FT5 表 1；这些输出文件包含菌落密度估计值、菌落面积、形状和颜色信息。

对于图像板上的每个384个位置，输出文件名会自动从源图像文件名复制。QFAR软件包包含函数seldens，可用于每个培养物的时间过程，以将广义逻辑种群模型拟合到观测数据并进行绘图。示例参见图二和图三。

拟合的参数值将写入QFA逻辑参数文件中。QFAR软件包还包含用于质量控制的函数。由于培养皿边缘营养物质更丰富且图像分析较为困难，边缘菌落将被舍弃。

靠近培养板壁的菌落以及未通过 SGA 筛选、基因型显示与筛选特异性标记基因存在连锁的样本将从分析中剔除。基于每个培养物的逻辑种群模型参数，计算出多种定量的适合度指标。这些指标包括每组重复培养物在接种至饱和期间的最大种群倍增速率和分裂次数，以及针对每种适合度定义的相应数值。

计算了适合度估计值的多个汇总统计量，包括适合度的均值和中位数、适合度的标准差以及观察到的重复次数。汇总统计结果将输出至QFA适合度汇总文件FT eight，表格一，用于进一步分析。例如，用于计算基因互作得分FT nine表格一。

该图显示了384孔板QFA在对数尺度下的一条典型生长曲线。菌落在固体琼脂培养基上于20摄氏度条件下生长，通过定殖分析量化，细胞密度的增加最早在接种后约两天可被检测到。这种延迟可能是接种至固体培养基后存在培养滞后期，以及细胞密度检测下限共同作用的结果。

此处从一块培养板上捕获了308条相似的生长曲线。请注意，产生平直线的菌株生长状态极差或已死亡。该图展示了通过两次全基因组QFA筛选实验来推断基因相互作用强度的比较结果。

QFAR 软件包还包含用于生成上述生长曲线图、输出被检测基因型的排序列表以及遗传相互作用强度估计值的函数。同时提供 Q 值，用于评估所观察到的遗传相互作用强度（GIS）的显著性。一旦掌握该技术，一个完整的全基因组范围、四次重复的 QF.A 实验可在三周内完成。在进行该实验过程中，重要的是要始终有条不紊地追踪和命名所有培养板及图像。

所有平板必须以正确的方向和顺序进行接种和点样。数据分析依赖于实验科学家构建的辅助文本文件的准确性。观看本视频后，您应能充分理解如何评估数千个独立微生物培养物的适合度。

通过反复拍摄生长在固体琼脂平板上的斑点培养物，将获取的图像转化为细胞密度的估计值，并由此生成生长曲线，从而估算适合度。对生长曲线进行数学建模可提供定量的适合度估计值，进而可用于推断基因产物在全基因组范围内的功能关系。