通过双光子成像检测小鼠大脑皮层内源性NADH荧光以识别微区域缺氧

本实验的总体目标是直接在活体小鼠大脑皮层中可视化微区域组织缺氧情况。首先，需在麻醉小鼠上制备开颅颅窗，随后通过静脉注射荧光染料以标记脑部血管。

最后，同步进行光子成像，以检测内源性NADH荧光及荧光标记的皮层微血管。最终，通过可视化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原形式的存在，可以获得显示脑实质微区域功能缺氧的结果。该技术相较于现有方法（如克拉克型电极）的主要优势在于，它能够在大视野范围内提供高空间分辨率，且侵入性更小。

该方法可在配备两个荧光通道的标准应用型双光子系统上进行。大家好，我是史蒂夫·赫斯特（Steve Hurst），罗切斯特大学微生物学与免疫学系教授兼主任。今天将由基什卡实验室的阿尼塔·森（Anita's son）以及我实验室的研究助理教授奥克萨娜·保尔卡（Oxana Paulka）演示该实验操作流程。开创了NADH成像技术的基什卡博士（Dr. Kishka）因近期已搬迁至德国，无法到场参与。在准备好手术区域并使用已通过高压灭菌或70%乙醇消毒的必要器械后，用5%异氟烷对小鼠进行麻醉，然后将其置于加热垫上，并佩戴面罩以在空气中持续输送1.3%至1.5%的异氟烷。

通过尾部夹捏检查麻醉水平。接着插入直肠探针，并在整个操作过程中持续监测动物的体温。在小鼠眼睛上涂抹人工泪液凝胶，以防止其眼睛干涩。

然后去除头部和双侧大腿的毛发，将脱毛剂涂抹于大腿部位持续两分钟，以清除残留毛发，大腿将用于血氧监测。最后，使用10%聚维酮碘溶液和70%乙醇对头皮进行消毒。制作颅窗时，从颅骨开始剪开约五毫米。

在头皮上做一个切口，并向前推进一厘米。将皮肤向两侧推开以暴露颅骨，去除颅骨表面的膜组织。应用10%氯化铁溶液。

擦去多余的溶液，用45度角刮去膜。第五步，使用镊子。在解剖显微镜下确定目标区域。在头板窗口边缘涂抹一层快速胶水。

将头板放置在使感兴趣区域暴露于窗口的位置，并对头板施加轻微压力。涂抹少量牙科水泥以快速聚合胶水。在胶水聚合过程中保持固定 10 秒。

在窗缘处涂抹少量速干胶，以密封头板和颅骨。然后在解剖显微镜下将头板拧紧至动物固定装置上。使用微型扭矩钻机，转速设定为 6,000 RPM，并配合 IRF 0 0 5 钻头进行操作。

清除颅骨和头板上的所有多余胶水。然后将钻机转速设为每分钟一千转，开始在头板窗口内钻颅骨，钻出一个直径约五毫米的圆形区域。操作时使用轻柔的扫动动作，就像用非常柔软的铅笔作画一样。

每钻 20 到 30 秒暂停一次，使用压缩空气清除骨屑。随着钻孔的进行，中央完整颅骨周围会形成一个凹槽。注意不要刺穿薄薄的颅骨，同时确保该凹槽厚度均匀。

此外，操作时需格外小心大血管区域。应避免损伤血管，最好甚至不要触碰。用镊子的一个尖端轻轻抬起窗口中央的骨片，并在窗口上滴加一滴人工脑脊液。使用Kimwipe纸的角落，以45度角轻轻擦拭，去除多余的人工脑脊液。

第五步，使用镊子。找到窗缘处硬脑膜受损的区域，将其提起并移除。如果发生出血，滴加一滴人工脑脊液，等待两到三分钟，使轻微出血停止。

接下来，配制 10 毫升含 0.07% 低熔点琼脂糖的人工脑脊液。将融化的琼脂糖加热至体温。用拭子擦去脑组织表面多余的脑脊液。

将气凝胶倒入载物窗中，并用盖玻片覆盖。然后轻轻按压盖玻片，使其与头板接触，静置10至20秒，直至气凝胶凝固。使用镊子和柔软的纸巾，从盖玻片上除去多余的气凝胶。

在玻璃周围涂抹少量速干胶，将其粘附至头板上。然后涂抹少量牙科水泥以固定胶水，便于注入股静脉。将动物部分翻转，以暴露左侧大腿内侧。

使用胶带固定动物。在此位置，对皮肤进行消毒剂擦洗，然后使用100%乙醇。接下来，从膝部沿大腿内侧向耻骨联合做一切口。

如有必要，用钝性解剖法分离软组织。用130微升德克萨斯红溶液填充一支1毫升注射器。安装一根新的30号针头，并小心地将其向上弯曲成30度角，保持斜面朝上。

在解剖显微镜下用Texas Red溶液填充针头，将针头插入股静脉并注射100 µL的Texas Red。拔出针头后用纱布轻轻按压静脉以止血。使用4-0缝线缝合皮肤，以便持续监测血氧饱和度。

将血氧探头放置在之前已去除毛发的右大腿上。开始成像时，将手术准备好的小鼠转移至显微镜载物台。使用明场照明在4倍放大下拍摄颅窗部位的初始图像，作为与高倍放大光子散射成像配准的参考图谱。

使用10倍放大倍数放大至目标区域。在皮层中选择一个目标区域。开始记录一个或两个时间序列。

建议使用三到五个平均帧来提高图像质量。接下来，通过向动物呼吸的空气中加入50%的氮气来诱导低氧血症，这将使氧水平降至10%。通过监测血氧仪数据来确认低氧血症。

继续记录低氧血症期间约30秒以及恢复正常氧水平后的时序数据。通过检测、测量和量化血管周围缺氧区域及富氧组织柱的面积，收集用于计算氧分布的数据。为确定缺氧组织柱半径R，需测量血管中心与检测到高NADH荧光信号边界之间的距离。

有关数据处理方法，请参阅书面实验方案。该图显示了在短暂低氧血症期间录制的视频中同时获取的NADH和地理图像，吸入氧浓度从21%降低至10%，持续三分钟。这种实验诱导的低氧血症水平足以在大脑皮层中引发严重缺氧。

缺氧导致NADH荧光增强，最初在远离动脉血液供应的区域呈现绿色。注意，NADH组织边界清晰，代表了来自皮层微循环（红色所示）的氧气扩散的可观测组织边界。此处为皮层荧光标记的微血管（红色）与皮层灰质内源性NADH荧光（绿色）的同步图像，NADH荧光强度分布呈二元性。

存在NADH荧光均匀较低的区域和NADH荧光均匀较高的区域。黄色线条代表低NADH荧光区域与高NADH荧光区域之间的组织边界。这些组织边界与邻近的微血管具有空间上的关联性。

这种关系由微血管向组织内氧气扩散所决定。在某些情况下，这些组织边界的圆柱形特征或CRO组织圆柱可被直接识别，如蓝线所示。此处，组织边界呈圆形，中央为同心的血管，一旦掌握。

如果操作得当，该技术可在1.5小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住将盖玻片粘附到金属板上，以防止由于水肿引起的皮层表面垂直移动。在完成此操作后，可进行进一步的分析，例如功能性充血的测量，以探讨组织缺氧与脑血管耦合之间的关系等其他科学问题。

观看本视频后，您应能充分了解如何在小鼠皮层中可视化微区域组织缺氧情况。