双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

以下所述的所有实验程序均经波兰科学院Nencki实验生物学研究所当地伦理委员会批准。本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠后压部皮层神经元的长期成像，使用的是活体双光子显微镜技术，并在单足转基因小鼠品系中进行。该方法结合了在背侧海马体注射表达mCherry的腺相关病毒（AAV）。

综合这些技术，可实现对经验依赖性和后顶叶皮层结构可塑性的长期监测。本文中，我们提出在后顶叶皮层上方植入颅窗，作为双光子活体显微成像的一个可行感兴趣区域。为了观察神经元结构的形态学变化，我们使用了 Thy1-GFP 转基因小鼠，其脑内约 10% 的神经元表达荧光 GFP 蛋白。

我们提出的另一项创新是将一种腺相关病毒（AAV）注射到大脑深部结构（如海马体）中，该病毒在神经元特异性启动子驱动下表达荧光蛋白mCherry，以可视化该结构向压后皮层的投射。将所有工具、盛装液体的玻璃容器和棉签在高压灭菌器中进行灭菌。请佩戴一次性手套。

使用70%乙醇清洁手术台、立体定位仪及周围所有区域。使用无菌手术垫为所有已灭菌的器械创建无菌操作空间。将明胶海绵切成小块，并浸泡于无菌生理盐水中。

将动物放入诱导室，设置异氟烷浓度为5%，氧气流速为每分钟2升。此过程应持续约3分钟。将动物从诱导室中取出。

通过尾部或脚趾夹捏来确认动物是否完全镇静。使用精密修毛剪，将耳朵之间至眼睛区域的头部后方毛发剪除。将动物置于立体定位仪中，并用耳杆固定头部。

将麻醉水平设置为1.5%至2%异氟烷和每分钟0.3升氧气。涂抹眼膏。皮下注射托法替尼（tolfedine），剂量为4毫克/千克，丁丙诺啡（butorphanol），剂量为2毫克/千克，以及拜耳灵（Baytril），剂量为5毫克/千克，分别用于预防炎症、疼痛和感染。

以每公斤0.2毫克的剂量向动物肌肉注射地塞米松，以防止脑肿胀。使用浸有聚维酮碘的无菌棉签清洁皮肤，随后用70%乙醇擦拭。更换手套，并用70%乙醇喷洒手套。

用镊子提起皮肤，使用显微剪沿头部基底水平剪开皮肤，然后斜向剪至两眼之间的前点。去除皮肤瓣。用无菌棉签将利多卡因软膏涂抹于骨膜上，以防止过度出血和疼痛。

使用无菌棉签或手术刀去除骨膜。用无菌棉签将颅骨擦干。使用无菌针头，将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂抹于皮肤边缘，以固定皮肤并防止其与牙科水泥进一步接触。

等待胶水干燥。将一片无菌的3毫米盖玻片覆盖在颅骨上，位置位于人字缝前方。盖玻片中心置于后顶叶坐标处，即前囟后方2.8毫米，正中矢状面两侧0毫米。

使用无菌针头划伤颅骨表面，标记盖玻片边缘。将盖玻片放回含有70%乙醇的无菌容器中。使用高速牙科钻配合小直径钻头，刻出一个直径为三毫米的圆形轮廓。

使用无菌生理盐水棉签清除钻孔部位的骨屑。使用明胶海绵和棉签控制偶尔出现的出血并清洁骨骼。在钻孔间隙，用精细镊子轻轻触碰骨环并检查其活动度，以评估骨厚度。

需要注意的是，骨缝区域的骨质较厚。当骨环已可活动，且周围仅剩一层均匀的薄层骨质时，停止钻孔。使用生理盐水浸湿的棉签清除手术区域残留的所有骨屑。

将无菌生理盐水滴加至钻孔区域，覆盖钻出的骨环。用精细镊子小心撬起骨环，然后轻轻而稳固地向上提起将其取出。提拉过程中注意避免倾斜骨环，以防对硬脑膜造成可能的损伤。

将浸有无菌生理盐水的明胶海绵轻轻贴附于硬脑膜上，以帮助止血。等待直至所有出血完全停止。小心移除明胶海绵，避免干扰凝血过程。

需要注意的是，缝合区域血管丰富，因此此处出血可能较为严重。必须等待足够的时间，直至出血完全停止。将输液泵连接至立体定位仪支架，并连接控制器。

将35号针头插入填充注射器中。用乙醇冲洗注射器10次以灭菌，并用无菌生理盐水冲洗10次以去除乙醇残留。排除注射器中的气泡。

将注射器插入泵中。吸取单剂量的AV制剂，并置于冰上保存。用病毒溶液填充注射器。

将针尖定位在前囟中心，然后根据以下坐标轻柔插入海马：前后方向负2，内外方向正负1，背腹方向负1。这些坐标位置靠近颅腔边缘。等待五分钟，使组织稳定。

以每分钟 50 纳升的速度注射 0.7 微升的 AV 溶液。等待 10 分钟，使病毒充分吸收。轻柔地取出针头。

若发生出血，用凝胶海绵按压止血。对侧重复相同操作。将无菌干燥盖玻片置于钻孔圆框内硬脑膜上方。

用镊子夹住盖玻片，轻轻压平硬脑膜，并使盖玻片边缘更贴近颅骨表面。使用无菌针头，将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂抹在盖玻片边缘，以将其固定在颅骨上。等待胶水完全干燥。

在颅骨前部放置一个固定杆、安东螺母或定制设计的装置。注意，固定杆的位置应确保在成像过程中颅窗能够保持水平。将胶水涂抹在固定杆的边缘。

等待胶水干燥。注意，固定杆应尽可能远离窗口放置。如果固定杆离窗口过近，则该杆及其与自制支架相连的螺钉可能在成像过程中阻碍物镜。

制备牙科丙烯酸树脂，并将其涂抹在颅骨表面玻璃周围的区域。在窗口周围形成一个类似火山口的形状会有所帮助，这样可为后续使用水浸物镜成像时所加的水创建一个容纳空间。

使用牙科丙烯酸材料制作一个帽状结构，覆盖手术区域其余部分的皮肤边缘，并固定加强颅窗周围区域的固定杆。等待牙科水泥完全硬化。将动物从立体定位仪上取下，并放入恢复舱中。

在观察生理功能的同时，等待动物从手术中恢复。术后给予镇痛药cyroproferrin，剂量为10毫克/千克，以及抗生素baytril，剂量为5毫克/千克，持续48小时。启动钛蓝宝石激光器，开启显微镜电源。

本实验所用系统配备双光子激光器、OPO 系统和双镓砷化物假象 PMT。将动物放入诱导室并诱导麻醉。从诱导室中取出动物，置于显微镜下的气体麻醉面罩中。

将氧气流速降低至每分钟0.3升，异氟烷浓度降至1.52%。使用MT螺钉或其他定制系统将动物固定在定制的显微镜框架上。调平颅窗。注意，虽然可以使用显微镜制造商提供的头部固定系统，但特定的定制框架能获得更好的结果，在慢性实验的多次记录中提供更佳的头部稳定性与位置重复性。

使用宽场显微镜设置，选择低倍物镜，将视野中心对准压后皮层的一侧边缘，并聚焦于盖玻片表面。在 crater-like 丙烯酸井中加入一滴水。切换至长距离水浸物镜。

将物镜移向颅窗，直至水的弯月面连接样本与物镜。切换至双光子设置，从上到下以最低放大倍数开始扫描样本。硬脑膜的穿过部位会表现为强烈的非特异性信号闪光。

根据荧光细胞的信号强度，调整显微镜在GFP和mCherry两个通道中的采集参数，以覆盖整个动态范围。找到一个树突结构与其他细胞分离的合适神经元后，仅使用GFP滤光片进行初始扫描，设置最低放大倍数和5 µm的Z轴步距。获取扫描图像堆栈的最大投影，并使用反相颜色打印，用于后续标注。

将放大倍数设置为能够清晰成像所需形态细节的数值。使用最大强度投影作为引导，对GFP和mCherry通道中的整个树突树进行成像。采用本方案，可对后扣带皮层中的突触前和突触后结构进行重复长期监测。

该方法可用于慢性实验，以观察树突、突触棘或突前神经元形态变化与行为学操作之间的相关性。成像可按任意频率进行，但推荐以24小时为间隔，以便动物充分恢复，并最大限度减少麻醉带来的影响。若操作得当，该技术可在数月内实现多次成像。