海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

本方案经过优化，可将多能性人类胚胎干细胞包封，并在三维系统中将其分化为多巴胺能神经元。首先，用ROCK抑制剂（RI）处理细胞集落，使其解离为单细胞，并与海藻酸钠混合后通过包封装置进行包封。继续使用RI处理三天，随后将包封的细胞转移至PA六孔板中，并进行为期28天的分化。

最终，基因和蛋白质表达分析表明，该方法在生成多巴胺能神经元方面具有更高的效率。与现有的二维分化方案相比，该技术的主要优势在于，我们尝试在三维环境中进行这些细胞的扩增和分化，而三维环境使细胞能够以高密度的方式进行扩增，同时为细胞间的相互作用提供了更佳条件，从而促进分化。

第三，还能提高后续分化过程的效率。此外，需要补充的是，该特定技术也可适用于其他可在三维环境中培养的细胞类型。需要注意的是，该技术的优化基于使用一种特定的 ROCK 抑制剂，以防止细胞凋亡以及细胞从培养皿上脱落。

通常，初次接触该方法的研究人员在初期会遇到一定困难，因为该技术在组织培养中并不常见。以下包封技术是基于 Dean 博士和 Chad 博士关于 R 抑制剂型海藻酸盐的应用、海藻酸盐浓度以及包封装置参数的总结研究而优化的。我们实验室的博士生 Jamie 和 Kim 将演示本实验方案。

在无菌的50毫升离心管中，将25毫升无菌0.1%明胶溶液加入275毫克纯化的海藻酸钠中，涡旋混匀以使海藻酸钠粉末部分溶解。然后将离心管置于10×g的轨道摇床上过夜。接下来，向海藻酸钠溶液中加入9%无菌氯化钠溶液。

涡旋30秒，然后以95 × g离心5分钟。将海藻酸溶液在4°C下避光保存。首先在黑暗环境中，用添加了10 µM ROCK抑制剂的培养基对人胚胎干细胞进行预处理。

在37摄氏度下孵育两小时。随后用DPBS洗涤细胞两次，以酶法解离细胞。加入accutase，孵育10分钟。

在 37 摄氏度下，使用细胞刮轻轻收集细胞，并转移至 15 毫升离心管中。用等体积的 SL 培养基中和 Accutase。然后将中和后的细胞通过 40 微米滤膜，收集到新的 50 毫升离心管中。

现在使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过离心沉淀细胞，小心弃去上清液，然后用预温的缓冲液洗涤细胞一次。

0.9%氯化钠。离心收集细胞并弃去上清液。为了包封人胚胎干细胞，首先用预热的海藻酸盐溶液重悬细胞。

为此，将一个 20 毫升注射器连接到软质塑料管上，并用注射器吸取海藻酸盐。然后使用注射器轻柔地混匀细胞悬液，避免产生气泡。接着将细胞吸回注射器中。

丢弃塑料管，然后将注射器连接到包封机上。接着安装微珠发生器、注射泵、气流计和氯化钙沉淀浴等仪器。确认包封机末端与培养皿收集点之间保持10厘米的间距。

接下来，将注射泵设置为每小时10毫升。气流速率为每分钟8升，压力为100千帕。将包封的细胞收集到预热的沉淀浴中，持续7分钟。

然后通过轻柔吸移将它们转移至含有20毫升0.9%氯化钠溶液的50毫升离心管中，让胶囊沉降到管底，轻轻弃去上清液，再用0.9%氯化钠溶液洗涤一次。接着将包封的细胞重悬于添加了ROCK抑制剂的预温培养基中，转移至培养瓶，并培养三天。

将小鼠基质细胞系 PA six 细胞接种于经 0.1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，并用多巴胺能神经分化诱导培养基预处理 24 小时。将胶囊转移至 50 毫升离心管中，静置使其沉降至管底。弃去上清液，将胶囊重悬于 PA six 细胞条件化多巴胺能神经分化培养基中。

培养基培养。将包封的人胚胎干细胞与PA六细胞单层共培养21天。更换培养基时进行换液。

每次仅更换一半培养基，继续培养PA6细胞以诱导其多巴胺能神经分化。加入诱导因子的培养基孵育一周。首先用移液器吸取胶囊并转移至15毫升离心管中。

当胶囊沉降至底部后，弃去上清液。用DPBS洗涤两次，每次均弃去上清液。然后加入5 mL去头裂解液，并充分混匀悬浮液。

在室温下孵育五分钟。离心收集沉淀后，去除上清液，用DPBS洗涤两次，随后将去上清的细胞用于单层培养或立即进行后续分析。在典型制备条件下，海藻酸盐微胶囊的直径介于400至500微米之间。

此处采用 C-F-D-A-P-I 检测法。通过对不同时间点的人包封胚胎干细胞的活力、增殖和凋亡进行分析，结果显示包封细胞的绿色活细胞比例达到 80%，可用于优化培养条件。有趣的是，ROCK 抑制剂具有防止解离诱导的细胞凋亡的作用，并能维持细胞活力，提示在 H-F-F-C-M 培养基中添加 ri 培养的包封人胚胎干细胞表现出更优的生长状态。

本示例采用细胞封装技术作为三维平台，将封装的人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。与预期一致，随着培养时间的延长，胚胎体的尺寸逐渐增大；在培养两到三天后，去封装的细胞表现出渐进的神经元形态，细胞存活率超过90%。基因表达分析显示多能性标志物OCT4的表达下调。

重要的是，经过七天分化后，神经前体细胞标志物PAC six和多巴胺能神经元标志物TH仍持续呈上调状态。进一步分化21天后的人胚胎干细胞显示，超过90%的神经元为TH阳性。Western blot分析证实，在三维（3D）与二维（2D）细胞培养系统相比，TH和PAC six的表达模式更为理想。

掌握该技术后，可在两小时内高效完成操作。请记住在包封前后均需用 ROCK 抑制剂处理细胞。不同的诱导剂或抑制剂可用于调整三维分化方案，以适用于未来的实验。

这种特定的技术可将人类ESL细胞进行包封，并在三维环境中诱导其分化，具有用于多种疾病、尤其是帕金森病的细胞治疗潜力。