在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

心血管疾病仍然是全球首要的死亡原因。传统的体外模型依赖于单层培养。然而，心脏，特别是心肌组织，具有复杂的三维各向异性和细胞组成。

因此，为了更好地模拟心肌的细胞组成和结构，提高体外模型中心肌组织构成的复杂性至关重要。本文展示了一种在新型微流控装置中构建三维成熟干细胞来源的人类心脏组织的实验方案。该装置包含一个三维主组织通道，内部设有椭圆形微柱，可诱导周围水凝胶包封的心脏细胞高度有序排列。

主通道两侧为含有注入端口的培养基通道，可实现营养物质在整个组织中的扩散。由于操作微流控装置需要格外小心，因此本方案的可视化展示有助于在带有嵌入式微柱以增强组织排列的微流控装置中正确构建三维心肌组织。为解离人的心脏成纤维细胞，首先将培养瓶从培养箱中取出。

将培养瓶放入生物安全柜中，开始吸去瓶中的废弃培养基。然后取三毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。盖紧瓶盖，轻轻摇晃培养瓶，使底部充分浸润于PBS中。

吸去 PBS。取 3 mL 37 摄氏度的胰蛋白酶加入培养瓶中。然后倾斜培养瓶并轻轻晃动，使底部完全覆盖。

随后放入培养箱中孵育四到六分钟。取三毫升 FGM3 培养基加入锥形瓶中以中和胰蛋白酶。用移液器反复吹打溶液，使仍附着在瓶壁上的细胞脱落。

将细胞悬液收集到15 mL Falcon管中。取10微升细胞悬液，加入血细胞计数板中，用显微镜进行细胞计数。将细胞悬液在250 ×g下离心4分钟。

离心后，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用新鲜的FGM3重悬细胞沉淀，制成每毫升含7500万个细胞的悬液。充分重悬细胞后，将离心管盖上松盖的管盖，放置一旁。

为了分离心肌细胞，将培养板从培养箱中取出，并吸除培养基。加入六毫升磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤各孔，使每孔中留有一毫升 PBS。小心吸除 PBS，注意不要扰动贴壁于培养板上的细胞。

向六孔板的每个孔中加入1 mL预热的TrypLE Express，共加入6 mL。将细胞与TrypLE共同孵育10分钟。孵育10分钟后，用6 mL含B27和胰岛素的RPMI培养基中和TrypLE，即向每个孔中加入1 mL RPMI培养基。

使用一支毫升移液器吸取溶液，并将其冲击孔板孔壁背面，以确保所有细胞均被吹打下来。将细胞悬液收集至15毫升Falcon管中。以300 ×g离心3分钟。

离心后，吸除培养基和 TrypLE。此步骤对于洗涤敏感的心肌细胞至关重要，可确保在三维心脏组织形成过程中完全去除 TrypLE。

将细胞沉淀重悬于5 mL RPMI培养基中，该培养基需添加B27和胰岛素。使用1 mL移液器反复吹打溶液，确保细胞悬液均匀。取10 µL细胞悬液，用于血细胞计数板计数。

将细胞以 300 G 离心 3 分钟。第二次离心后吸除上清液。加入适量 RPMI 加 B27 加胰岛素，制成每毫升含 7500 万细胞的悬液，然后重悬。

为制备用于包封的胶原蛋白溶液，需将所有试剂置于生物安全柜内的冰盒上。然后取75 µL的胶原蛋白储备液。由于胶原蛋白黏度较高，需缓慢使用移液器吸取，再滴加至预冷的微量离心管中，并置于冰上。

取13.85 µL RPMI，加入Falcon管中的胶原中。然后取10 µL酚红，加入冰上的混合物中并重悬。最后，取1.15 µL 1 N NaOH，加入悬液中以中和。

然后取一支200微升枪头重悬该悬浮液。下一步是将细胞包埋于胶原基质凝胶中。接着取8微升心肌细胞样品，加入预冷的Falcon管中，置于冰上。

然后取 2 µL 的 CS，加入到细胞混合物中。重悬细胞悬液，取 5.6 µL 细胞悬液放入一个新的 Falcon 管中。接着取刚刚配制好的胶原蛋白，吸取 4 µL 胶原蛋白，再取 2.4 µL Matrigel。

用移液器上下吹打混合物，以确保细胞水凝胶悬浮液均匀分布。凝胶注射剂准备好后，即可将其注入装置中。更换新的枪头并重新悬浮。

取含有装置的培养皿，将移液枪头插入注入口，缓慢而稳定地注入。您将观察到装置的通道逐渐充满细胞水凝胶悬浮液。当另一端的注入口也被完全填充后，停止注入并移除枪头。

注射后，用镊子将装置翻转，并放入含有水的较大培养皿中，在培养箱内孵育九分钟。九分钟后，将装置从培养箱中取出，正置，然后重新放回培养箱中继续孵育九分钟，以完成水凝胶的聚合。现在可以加入培养基了。

因此，取RMPI加B27，将枪头插入培养基端口并缓慢推入。然后对另一侧的培养基端口进行相同操作。您可能会发现培养基无法注入，此时可在端口上方滴加一滴培养基，然后用移液枪从另一侧施加负压，将培养基抽吸通过。

因此，当培养基开始被吸入通道时，您将看到这一过程。一旦所有培养基通道都已加入培养基，装置将被放回37摄氏度的培养箱中。微流控装置显示在左上角。

图中展示了培养第1天、第7天和第14天的情况。培养14天后，细胞应收缩形成围绕微柱的高度有序结构。此处C图展示了第14天自发收缩的轨迹，以及肌动蛋白染色和心肌标志物染色组织的免疫荧光图像。

应观察到在培养14天后形成的高度排列的肌动蛋白纤维，以及平行的条纹状成熟肌节和局部的缝隙连接。在该操作过程中，关键是要在细胞水凝胶注射期间将所有材料保持在低温冰上，以防止过早聚合。在微流控装置的制备、注射以及长期组织培养过程中，均应小心操作。

细胞注射过程应保持稳定，以确保整个通道被完全填充，同时操作需迅速，以防止在添加培养基之前发生过早的聚合或水凝胶干燥。