在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

以下实验的总体目标是在模拟生理条件下三维环境的微腔阵列上，观察细胞器的形态与动态。对于具有刚性细胞壁的细胞（如裂殖酵母），微腔可组织并定向细胞结构。该目标首先通过母版制备PDMS柱阵列，再经复制成型获得PDMS微腔阵列（称为“卵杯”）来实现。

第二步，将“蛋杯”用细胞外基质蛋白进行功能化处理，并放入含有定制圆柱形塑料部件的试管中，该塑料部件可支撑微腔样品，并允许将单个哺乳动物细胞分别引入各个微腔。随后，取出载有细胞的蛋杯，并与目标药物或化合物共同孵育，以研究细胞在三维限域环境中的表型及动态过程。实验结果表明，与基于细胞取向的传统二维体外实验相比，细胞表型存在差异，并可观察到新的动态结构。

与现有的标准 2D 细胞培养检测等方法相比，该技术的主要优势在于，哺乳动物细胞在“蛋杯”中所处的 3D 环境类似于生理微环境，同时细胞排列有序且标准化。对于裂殖酵母而言，细胞的有序性和取向性也得到了显著改善。该方法有助于回答细胞骨架和药物发现领域中的关键问题，例如通过高内涵筛选鉴定新的抗癌药物。

该技术的应用可拓展至癌症等多因素疾病的诊断，因为借助“蛋杯”可轻松进行并分析药物筛选实验，使该方法在个体化医疗领域具有重要意义。该方法能够揭示单个哺乳动物细胞和裂殖酵母细胞中有序结构与动态行为的关键信息，也可应用于组织化研究以及秀丽隐杆线虫（C.elegans）和水稻花粉（ri-so-flu-a）等发育胚胎的研究。在本实验方案中，通过复制模塑法将微腔阵列（即“蛋杯”）图案化于粘附在盖玻片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层表面。

第一步是制备模具，此过程不会展示，但文本方案中有详细描述。模具制备完成后，下一步是制作PDMS复制品。在50毫升试管中，按1比10的重量比或体积比，将交联剂与预聚物充分混合，总质量为30克。

将离心管在1,800 × g条件下离心五分钟，以去除气泡。轻轻将PDMS滴加到模具表面。如果出现气泡，则对混合物进行脱气处理。

将样品置于65摄氏度的烘箱中加热四小时。PDMS固化后，使用手术刀轻轻切割出约一平方厘米的感兴趣区域，该区域包含约10的5次方个微腔或卵杯结构。然后轻轻剥离PDMS印模。

开始复制模塑操作时，先将PDMS印章用氧气等离子体处理30秒以进行活化。将活化后的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。在通风橱内操作，将活化的PDMS印章放置于培养皿中，使带有微结构的一面朝上或倒置朝上，并将其置于一个15毫升瓶盖旁边。

用 200 微升三甲基氯硅烷填充瓶盖。盖上培养皿，让印章硅烷化七分钟。将 PDMS 印章放置在旋涂仪上，使结构面朝上。

在结构顶部滴加少量液态PDMS。以1500 RPM转速旋涂30秒，使PDMS在结构表面形成一层薄层。将印模置于65摄氏度的烘箱中加热四小时，固化旋涂沉积的PDMS层。

接下来，将PDMS印章朝上放置，并与玻璃盖玻片一同置于氧气等离子体清洗仪中处理30秒，以激活薄PDMS层。立即让印章与玻璃盖玻片接触，并用镊子轻轻按压印章表面四周，使其粘合。随后，在印章顶部保持恒定压力约10秒钟。

30 分钟后，小心地将印模从盖玻片上剥离，以释放出卵杯结构。操作时务必格外小心，避免损坏样品。用乙醇彻底冲洗卵杯，并进行干燥。

如果在去针步骤期间PDMS卵杯未附着在玻璃盖玻片上而发生脱落，请考虑调整等离子清洗仪的设置，并重新开始复制 molding 的步骤。为了便于后续对样品的操作，建议将一小块固化的PDMS粘附在盖玻片边缘。对于本视频中所展示的哺乳动物细胞，必须用细胞外基质的黏附蛋白对PDMS表面进行功能化处理。

将“蛋杯”置于氧气等离子体清洗仪中亲水化处理30秒。随后，用紫外光照射5分钟以对“蛋杯”进行灭菌。加入少量纤连蛋白溶液，覆盖整个“蛋杯”区域，并在室温下孵育1小时。

防止样品干燥。使用塑料移液管，用约一毫升的 PBS 轻轻冲洗“蛋杯”结构，重复冲洗共三次。

接下来，将定制的圆柱形塑料件放入一个 50 毫升的离心管中。向管中加入 13 毫升细胞培养基。培养基液面应至少高出圆柱形塑料件 2 厘米，以确保样品完全浸没。

使用锋利且笔直的镊子夹住样品的 PDMS 手柄，小心地将卵杯放入管内，轻轻按压盖玻片，使其位于塑料片的上表面并完全浸没。待引入卵杯的细胞应培养至 80% 至 100% 汇合度，并重悬于五毫升培养基中。用移液器吸取 200 微升细胞悬液，滴加在卵杯上方，尽量将细胞滴加在卵杯中央位置，但避免与卵杯发生物理接触。

这将防止样品破损和/或损坏。将50毫升离心管在1,800 × g下离心2分钟。再用移液器将200微升细胞加到卵杯顶部，并在1,800 × g下再次离心2分钟。

重复此步骤共三次，以优化填充率。最后一次离心后，使用显微镜检查卵杯的填充率。用镊子夹住PDMS手柄，小心地将样品从管中取出，避免扰动卵杯中的细胞，并将样品放入含有培养基的培养皿中。

为去除未进入卵杯中的多余细胞，用移液器在微结构阵列的每一侧轻轻吹打上下三次进行冲洗。最后，更换为新鲜培养基以清除未贴附的细胞。为观察固定的细胞器，将含有固定样品的卵杯置于倒置荧光显微镜的载物台上，并选择60倍油镜。

在此示例中，样本为 NIH 3T3 成纤维细胞，其中高尔基体、细胞核和肌动蛋白纤维已被染色。使用明场照明仔细对焦，直至卵杯和细胞处于观察平面上。选择并聚焦目标区域，然后开始图像采集。

开始此操作时，先将卵杯放入显微镜载物台支架中，并加入一毫升含10%FCS的L15细胞培养基。将支架安装在显微镜载物台上。为避免蒸发，将玻璃盖板盖在支架上方。

使用配备60倍油镜的倒置落射荧光显微镜观察细胞。本示例采用表达荧光标记肌球蛋白和肌动蛋白的HeLa细胞，这两种分子是细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合的关键组分。选择感兴趣的区域，并通过GFP或Texas Red通道寻找胞质分裂环。

准确对焦。在两个通道中运行自动采集，直至收缩环完全闭合。卵杯的扫描电子显微镜图像显示，其形状和尺寸非常规则。

对于具有 rigid 壁的细胞（如裂殖酵母），卵杯结构可引导胞质分裂环的定向。对于哺乳动物细胞，比较其在 3D 卵杯结构与 2D 平面表面上的生长情况发现，前者形成具有均一球形样表型的有序阵列，而后者则呈现无序且异质的形态。此外，在卵杯结构上生长的细胞其应力纤维数量减少，这一点可通过 Blebbistatin 处理产生的轻微效应数量减少得以证实。

在二维培养条件下，高尔基体通常呈现延展的表型，而在“蛋杯”结构中则表现出更为紧凑的表型。该现象已通过高尔基体表型的定量分析得以证实。此外，在二维表面上，细胞核的取向是随机的；而在蛋杯结构中，无论是野生型细胞还是经Blebbistatin处理的细胞，其细胞核均在xy平面上呈正交取向。

细胞核球形度值的测定结果显示，卵杯结构不会影响细胞核正常的球形度。然而，卵杯上野生型细胞与经Blebbistatin处理的细胞之间的差异表明，卵杯能够揭示药物在二维培养中被掩盖的真实效应。利用卵杯进行的活细胞研究可识别出在标准培养条件下无法观察到的新型活性过程。

例如，在 HeLa 细胞中观察到有丝分裂过程中随着分裂收缩环的闭合，肌球蛋白出现周期性聚集并呈径向移动的现象。一旦掌握技术，可在六小时内利用模具复制制备出“卵杯”结构，细胞填充过程约需 15 分钟。在尝试该操作时，需特别注意“卵杯”的尺寸应与所研究的细胞大小相匹配。

该方法还可进一步适用于制药公司的高内涵筛选平台，用于大规模筛选，也可用于患者的个性化诊断检测，以评估个体化的特异性治疗方案。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和使用“卵杯”微腔结构。“卵杯”可为多种类似系统建立标准化并生成有序排列，适用范围从无细胞壁的单个细胞（如哺乳动物细胞）到具有细胞壁的系统（如酵母和胚胎）。