以单细胞和单峰分辨记录超阈值神经活动的光学成像

FollowMe 实验的总体目标是从大量神经元中记录神经元的放电活动。第一步是通过荧光显微镜观察每个动作电位发生时神经元胞体中细胞内钙离子浓度的升高，从而实现这一目标。利用双光子激发和随机访问扫描原理，可以以高空间和时间分辨率记录来自40个神经元胞体的钙荧光信号。

在第二步中，使用反卷积算法从荧光信号中提取精确的峰电位时间。该技术可用于记录数十个神经元的放电活动。随后，可利用这些放电数据来测量神经元群体之间的互信息、信号传播或神经相关性。

与现有的微电极记录等方法相比，该技术的主要优势在于能够同时记录局部神经元群体中大量神经元的放电活动。该方法有助于回答关于皮层局部神经网络功能的关键问题，例如信息编码中相关性的作用，以及皮层可塑性过程中网络动力学的改变。对于双光子激发，需使用具有飞秒脉冲的红外脉冲激光系统。由于系统光学元件会引入较大的损耗，因此需要较高的激光输出功率以补偿这些损失。

每个系统由两个棱镜组成的预啁啾器，在激光脉冲到达声光偏转器（AOD）之前的光路中引入负群速度色散，以补偿AOD引入的时间色散。两个具有大孔径的AOD实现激光束的二维偏转。在AOD后方13厘米处放置一块每毫米100条刻线的反射式衍射光栅，用于补偿AOD引入的空间色散。使用短激光脉冲时，激光束通过两组中继望远镜导入直立显微镜的相机端口。

虹膜光阑以规则间隔放置，用于光学元件的对准。物镜前方的二向色分光镜将红外激发光透射至样品，并将样品发出的荧光反射至探测器。通过物镜和聚光镜的落射与透射荧光探测器收集荧光信号，彩色玻璃滤光片置于探测器前方，以防止激发光到达探测器。

声光偏转器（AOD）的偏转角度由配备数字-模拟转换板的计算机控制，该转换板进而驱动电压控制振荡器。光电倍增管输出的信号通过截止频率为100千赫的低通巴特沃斯滤波器，再由模拟-数字转换器以156.25千赫的时钟频率进行数字化，随后存储于计算机中用于分析。通过记录在有无激光照射、光电倍增管低增益和高增益条件下以及有无指示剂存在时荧光信号的分布情况，来检测系统对准和电噪声水平。随机访问扫描依赖于对细胞内钙离子浓度升高的检测。本实验方案的第一步是通过团注法将大量神经元用钙指示剂的乙酰氧基甲基酯（ester）形式进行染色。

接下来，在四个位置分别记录每个神经元胞体的活动，每个位置记录 6.4 微秒。为选择目标神经元，先获取一个由 256 × 256 像素组成的完整帧图像，然后在此图像中手动选择待记录神经元的中心位置。

每个周期中，控制软件会自动在每个中心周围距离两微米的位置添加三个点。从所有40个神经元的四个位置记录荧光信号。在一个周期内完成所有神经元的记录需要1.536毫秒。

对全部40个神经元重复进行五秒钟的顺序记录。从荧光胞体钙信号中检测动作电位依赖于高信噪比。通过提高激发光强度可实现高信噪比。

然而，由于光损伤的存在，激发强度只能增加到一定限度。只有在一个非常有限的激发强度范围内，光损伤较低且信噪比足以检测单个动作电位，才能确保记录到的信号处于高动作电位检出率的窗口内。在实验过程中，会使用本实验室开发的多种在线分析软件。

接下来，从约100至200毫秒的基线噪声短时间窗口中，计算每个神经元的近似光子速率。通过用该方程拟合相对荧光变化的分布，从荧光值中计算光子数量和光子速率；然后从同一时间窗口计算基线荧光，并将其作为时间或实验次数的函数进行绘图。通过调节激光功率，使基线的平均下降速率保持在每秒0.0002以下。

因为超过此限值后，动作电位的检测效率会迅速下降。此后，每隔10到20分钟通过采集全帧图像来验证神经元胞体的位置。如有需要，调整记录位置。

由于钙瞬变的衰减时间较长，神经活动产生的荧光信号在时间上常常发生重叠。本实验步骤中，采用去卷积方法从荧光信号中恢复出动作电位及其发生时间。此处我们使用遗传算法来确定最符合记录荧光信号的放电序列模型。

随着算法的每一次迭代，最大似然值渐近地趋近于由荧光记录噪声所决定的最大值。在非均质神经元群体中，动作电位引发的钙信号在不同神经元之间可能存在差异。为了对大规模数据集进行无监督分析，我们设计了一种算法，该算法考虑了神经元间动作电位引发钙信号的变异，以避免大量假阳性检测结果的出现。

在相同类型神经元和相同实验条件下进行的另一组独立实验中，记录了单个峰电位诱发的钙瞬变的幅度和衰减时间常数的联合分布。为了校正缓慢的基线变化并降低去卷积的计算成本，将较长的记录数据按每个神经元每次记录划分为若干段较短的轨迹，每段持续时间为一至五秒；去卷积算法可测试大量模型，最多可达一百万个或更多不同的模型。为加快去卷积速度，可同时在最多10台不同的计算机上并行对一个实验数据进行去卷积处理。

去卷积后，对尖峰数据进行分析和检查。自动计算刺激前后的时程直方图尖峰概率以及神经元放电率。以下是检测时间窗口内以极低激发速率和极高激发速率记录的荧光信号示例。

请注意，每个示例展示的是对单个脉冲的响应。图中显示的是急性脑切片的显微照片，以及放置在同一皮层柱内的两个刺激电极。在第四层中，这些展示了神经元对重复刺激的响应，该图显示了由记录的神经元群体传递的香农互信息。

以下是不同皮层神经元群体之间超阈值放电活动传播的测量结果。这些是皮层神经元在丘脑皮层纤维电刺激下的反应中检测到的放电事件。使用随机访问扫描记录神经元活动时，非常关键的是要在检测时间窗口内进行记录。

否则，很容易得到无法使用的数据集。光学尖峰检测仍处于初级阶段，还有很大的改进空间。

经过一些改进，我们能够记录更多神经元的活动。通过其他改进，我们将能够在清醒且行为正常的动物中进行记录。